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1 | PMID | 24415674 | 26003046 | 26319512 | |||||||||||||||||||||||
2 | DOI / link | doi: 10.1002/humu.22511 | doi: 10.1007/s00438-015-1067-x | DOI: 10.1016/j.gene.2015.08.045 | |||||||||||||||||||||||
3 | Author | Mercimek-Mahmutoglu | Desroches | Mercimek-Mahmutoglu | |||||||||||||||||||||||
4 | Year | 2014 | 2015 | 2016 | |||||||||||||||||||||||
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6 | Assay (general description) | In vitro expression of cDNA constructs in GAMT-deficient cell line followed by assay of GAMT activity and Western blot (19 missense variants, 17 of which were found in patients with GAMT deficiency) | In vitro expression of cDNA constructs in HeLa cells followed by assay of GAMT activity and Western blot (14 novel missense variants) | In vitro expression of cDNA constructs in GAMT-deficient cell line followed by assay of GAMT activity and Western blot. | |||||||||||||||||||||||
7 | Material used (patient cells, engineered variants, cell lines, animal model, etc. | Missense variant were introduced into a pGAMT-EGFP plasmid by site-directed mutageneis (see PMID 26319512) and expressed in a primary GAMT-deficient human fibroblast cell line (homozygous for a frameshift variant; note - variant was not provided in the paper). | Missense variant were introduced into a pGAMT-EGFP plasmid by site-directed mutageneis and expressed in HeLa cells. The fidelity of the insert was verified by sequencing. | Missense variant were introduced into a pGAMT-EGFP plasmid by site-directed mutageneis and expressed in a primary GAMT-deficient human fibroblast cell line (same method as PMID 24415674). | |||||||||||||||||||||||
8 | Readout type (qualitative/quantitative) | Quantitative (enzyme assay), qualitative (Western blot) | Quantitative for three variants with deficient activity (Fig 1), and qualitative for the remaining 6, which all have "normal activity" (enzyme assay). | Qualitative ("similar levels as the wild type") | |||||||||||||||||||||||
9 | Readout description | % of recombinant wild-type GAMT activity | % of recombinant wild-type GAMT activity | % of recombinant wild-type GAMT activity | |||||||||||||||||||||||
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11 | Biological replicates (met/not met) | met; Transfections were performed in triplicate | met; Transfections were performed in triplicate | met; Transfections were performed in triplicate | |||||||||||||||||||||||
12 | Technical replicates (met/not met); description | not met? | not met? | not met? | |||||||||||||||||||||||
13 | Basic positive control (met/not met); description | met; wild type pGAMT-EGFPN1; GFP signal indicates successful transfection; cells with normal GAMT activity also included | met; wild type pGAMT-EGFPN1; GFP signal indicates successful transfection. | met; wild type pGAMT-EGFPN1; GFP signal indicates successful transfection; cells with normal GAMT activity also included | |||||||||||||||||||||||
14 | Basic negative control (met/not met); description | met; 1) pEGFPN1 empty vector, 2) untransfected cells | met; 1) pEGFPN1 empty vector, 2) untransfected cells | met; 1) pEGFPN1 empty vector, 2) untransfected cells | |||||||||||||||||||||||
15 | Validation controls P/LP (#) | At least 2: One "known pathogenic missense variant" c.590T>C (p.Leu197Pro), one LP (without functional data included) based on the assessment of this VCEP. Four additional variants P/LP in ClinVar (need to be assessed without functional data - this will be done as part of the pilot study) | One LP in ClinVar ((need to be assessed without functional data - this will be done as part of the pilot study) | None | |||||||||||||||||||||||
16 | Validation controls B/LB (#) | One benign control: c.79T>C (p.Tyr27His) (MAF in gnomAD = 0.004706 (Latino), 0.004298 (European NF), 2 homozygotes in European NF; a patient who is homozygous for this variant has normal GAMT activity. | None (based on MAF cut-offs for BA1 and BS1 assigned by this VCEP) | None | |||||||||||||||||||||||
17 | Statistical analysis (general description) | Error bars show standard error of the mean for enzyme activity for triplicate transfections (Figure 1). | Mean of biological triplicates measured as % of pGAMTvariant 1-EGFP-N1 wild type. | not met | |||||||||||||||||||||||
18 | Threshold for normal readout | Not provided | Not provided | Not provided | |||||||||||||||||||||||
19 | Threshold for abnormal readout | Not provided | Not provided | Not provided | |||||||||||||||||||||||
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21 | Approved assay (y/n) | Yes | Yes | Yes | |||||||||||||||||||||||
22 | Proposed strength | Supporting | Supporting | Supporting | |||||||||||||||||||||||
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