2023.12.13_tGSH_GSSG_PT-BR.xlsx

	B	C	D	E	H	I	J	K	L	O	P	Q	R	S	T	U	V	W	X	Y	Z	AA	AB	AC	AD	AE	AF	AG	AH
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2	Data do expto:	2023.00.00			2. Conferindo Soluções					5. Ensaios para medição de GSSG e tGSH
3					2.1 NADPH					5.1 GSSG
4	1. Soluções				1. Em uma cubeta de quartzo, adicionar água milliQ e "zerar" o espectrofotometro em 340 nm.					Para medir especificamente a concentração de glutationa em sua forma dissulfeto (GSSG) as amostras devem ser incubadas com 2-VP para bloquear os grupos tiol (-SH) das moléculas de glutationa na forma reduzida (GSH).
5	Com exceção da água, que deve permanecer em temperatura ambiente, todas as demais soluções devem ser mantidas em gelo ao longo do experimento.
6					2. Diluir, direto na cubeta, um pequeno volume de solução estoque de NADPH (e.g., 10 µL ).					A reação entre 2-VP e grupos -SH leva 1 h para acontecer em temperatura ambiente.
7					3. Homogeneizar o conteúdo da cubeta com ajuda de um parafilm.					Está incubação ocorre diretamente na placa do ensaio e deve ser realizada em cabine exaustora com uso de EPI.
8					4. Ler em 340 nm.					5.1.1 GSSG - Ensaio
9	1.1 Soluções preparadas com antencedência				5. Repetir mais duas vezes (3 x no total).					1. Trabalhando em capela exaustora, adicionar em uma placa de 96 poços os reagentes conforme concentrações e volumes descritos na tabela abaixo até o asterisco (*), que marca um ponto de parada para incubação. Curva-padrão e amostras são adicionadas e lidas simultaneamente na placa.
10	1.1.1 10% (p/v) Ácido tricloroacético (TCA)
11	Diluir solução estoque de 100% TCA em água milliQ usando os volumes abaixo.				2.1.1 Cálculo																Curva-Padrão
12					Vol. final cubeta (µL)		800			2. Fazer adição dos reagentes em triplicata para cada ponto da curva ou amostra.											Inclinação	80.454
13					Vol. sol. NADPH (µL)		10			3. Deixar placa tampada no interior da cabine exaustora por 1 h.											Intercepção	7.433
14	Vol. desejado (mL)	50								4. Adicionar demais reagentes descritos na tabela após o (*) e tampar a placa.											R^2	0.9993
15	Vol. 100% TCA (mL)	5				Leitura	A340		NADPH estoque (mM)	5. Levar placa tampada até o leitor de placas e realizar leitura no modo cinética (tempo total = 90 s; intervalo = 15 segundos) em 412 nm. Se o número de amostras for grande, aumentar o intervalo, contanto que sejam feitas pelo menos 5 leituras dentro do período total.
16	Vol. água milliQ (mL)	45				Leitura 1	0.622		NADPH estoque (mM)
17						Leitura 2	0.622		8.00
18	1.1.2 KPE - tampão 500 mM KPi + 5 mM EDTA (pH 7.0)					Leitura 3	0.622			6. Registrar na planilha os valores da velocidade de variação da absorbância em 412 nm ao longo do tempo ("Vmax" ou "rate") na planilha.
19	Verificar em outro protocolo como preparar o tampão fosfato + EDTA e corrigir o pH.						0.622
20
21					2.2 Glutationa Redutase de levedura (GR)					5.1.1.1 Curva-padrão
22	1.1.3 Tampão PBS 1x				Diluir um pequeno volume (e.g., 2 µL) da solução estoque de GR de levedura em PBS 1x.					Posição	ID	KPE	Solução Padrão GSSG	10% TCA	500 mM	*	500mM KPi	Água	DTNB + GR	5 mM NADPH	GSSG (μM)	(A412nm/min)*1000
23	Verificar em outro protocolo como preparar PBS 1x.				O volume final vai depender da atividade/concentração de GR que foi aferida pela última vez ou a concentração no frasco original caso esteja lacrado.					Posição	ID	KPE	Solução Padrão GSSG	10% TCA	2-VP		500mM KPi	Água	DTNB + GR	5 mM NADPH	Na placa	i	ii	iii	Média
24										A1–A3	Blank	0	0	0	0		0	200	0	0	Blank	0.000	0.000	0.000	0.000
25	1.2 Soluções para preparar no dia				Última medida de atividade da GR estoque:					B1–B3	Zero	45	0	15	3		30	57	40	10	0.000	7.221	7.507	7.364	7.364
26	1.2.1 4 mM DTNB (396.3 g/mol) em 100 mM KPi pH 7.0								Vol. (µL)	C1–C3	0.2 µM	45	10	5	3		30	57	40	10	0.010	8.093	7.936	8.036	8.022
27	Diluir alíquota em tampão usando os volumes/proporções abaixo.				Data	Atividade (U/mL)		GR estoque	2	D1–D3	0.4 µM	45	10	5	3		30	57	40	10	0.020	9.536	8.964	9.250	9.250
28	Adicionar primeiro o tampão, depois a água.				6-Oct	436.44		PBS 1x	783.6	E1–E3	0.8 µM	45	10	5	3		30	57	40	10	0.040	11.307	10.564	10.279	10.717
29	Agitar em vortex até solubilizar todo o reagente.							Vol. Final	785.6	F1–F3	1.6 µM	45	10	5	3		30	57	40	10	0.080	13.593	13.664	13.621	13.626
30										G1–G3	3.2 µM	45	10	5	3		30	57	40	10	0.160	21.193	20.964	20.007	20.721
31		Peso (mg)		Vol. (µL)	2.2.1 Ensaio					H1–H3	6.4 µM	45	10	5	3		30	57	40	10	0.320	32.364	34.350	32.336	33.017
32		15.852	-----	10000	1. Em uma cubeta de quartzo, adicionar água e "zerar" espectrofotometro em 340 nm.
33		21.90	-----	13815.3	2. Em seguida, adicionar os reagentes nas concentrações e volumes abaixo.					5.1.1.2 Amostras
34			KPE	2763.1						Posição	ID	KPE	Amostra	10% TCA	500 mM	*	500mM KPi	Água	DTNB + GR	5 mM NADPH	(A412nm/min)*1000				GSSG (μM)	GSSG (μM)	Diluição	ID	GSSG (μM)
35			Água	11052.2	KPE	Água	20 mM GSSG	~1 U/mL GR	8 mM NADPH	Posição	ID	KPE	Amostra	10% TCA	2-VP		500mM KPi	Água	DTNB + GR	5 mM NADPH	i	ii	iii	Média	Na placa	No sobrenadante	Homogeneização	ID	Na amostra
36					80	665.0	40	5	10.0	A4–A6	Smp_1	45	15	0	3		30	57	40	10	10.000	10.000	10.000	10.000	0.032	0.425	1.11	Smp_1	0.47
37	1.2.2 20 mM GSSG (612.63 g/mol) em água									B4–B6	Smp_2	45	15	0	3		30	57	40	10	11.000	11.000	11.000	11.000	0.044	0.591	1.11	Smp_2	0.66
38	Diluir alíquota em água usando os volumes/proporções abaixo.				3. Com um parafilm, homogeneizar conteúdo da cubeta e realizar leitura.					C4–C6	Smp_3	45	15	0	3		30	57	40	10	12.000	12.000	12.000	12.000	0.057	0.757	1.11	Smp_3	0.84
39	Esta solução servirá apenas para verificar a atividade da solução estoque de GR.				4. Leitura cinética em 340 nm, tempo total 90 s, intervalo ≤10 s.					D4–D6	Smp_4	45	15	0	3		30	57	40	10	13.000	13.000	13.000	13.000	0.069	0.923	1.11	Smp_4	1.03
40					5. Repetir mais duas vezes (3 x no total).					E4–E6	Smp_5	45	15	0	3		30	57	40	10	14.000	14.000	14.000	14.000	0.082	1.088	1.11	Smp_5	1.21
41	Esta solução pode ser armazenada em geladeira e reutilizada por 1-2 meses.									F4–F6	Smp_6	45	15	0	3		30	57	40	10	15.000	15.000	15.000	15.000	0.094	1.254	1.11	Smp_6	1.39
42					2.2.2 Cálculo					G4–G6	Smp_7	45	15	0	3		30	57	40	10	16.000	16.000	16.000	16.000	0.106	1.420	1.11	Smp_7	1.58
43		Peso (mg)		Vol. (µL)						H4–H6	Smp_8	45	15	0	3		30	57	40	10	33.000	33.000	33.000	33.000	0.318	4.237	1.11	Smp_8	4.71
44		12.2526	-----	1000		Leitura	A340/min
45		5.00	-----	408.1		Leitura 1	0.0622			5.2 tGSH
46						Leitura 2	0.0622			Para medir a concentração de glutationa total, usamos glutationa na forma reduzida (GSH) para construir a curva.
47	1.2.3 20 mM GSSG (612.63 g/mol) em 10% TCA					Leitura 3	0.0622			5.2.1 tGSH - Ensaio
48	Diluir alíquota em 10% TCA usando os volumes/proporções abaixo.					Média	0.0622			1. Na bancada, adicionar em uma placa de 96 poços os reagentes conforme concentrações e volumes descritos na tabela abaixo. Curva-padrão e amostras são adicionadas e lidas simultaneamente na placa.
49	Esta solução é o estoque para produzir a curva-padrão de GSSG.					GR na cubeta	0.01 U/mL
50	Esta solução pode ser armazenada em geladeira e usada por 30 dias.									2. Fazer adição dos reagentes em triplicata para cada ponto da curva ou amostra.											Curva-Padrão
51					Atividade de GR (U/mL), frasco estoque*:			628.5		3. Levar placa tampada até o leitor de placas e realizar leitura no modo cinética (tempo total = 90 s; intervalo = 15 segundos) em 412 nm. Se o número de amostras for grande, aumentar o intervalo, contanto que sejam feitas pelo menos 5 leituras dentro do período total.											Inclinação	36.118
52		Peso (mg)		Vol. (µL)	*Ensaio realizado em: 06-Oct-2023																Intercepção	1.989
53		12.2526	-----	1000						4. Registrar na planilha os valores da velocidade de variação da absorbância em 412 nm ao longo do tempo ("Vmax" ou "rate") na planilha.											R^2	0.9999
54		5.00	-----	408.1	3. Preparando solução de uso de GR + DTNB
55					3.1 Calculando volume necessário para realizar o ensaio					5.2.1.1 Curva-padrão
56	1.2.3.1 GSSG - Soluções-Padrão									Posição	ID	KPE	Água	Solução Padrão GSH	10% TCA	DTNB + GR		5 mM NADPH	GSH (μM)	(A412nm/min)*1000
57	Diluir solução estoque (20 mM) em 10% TCA usando os volumes/proporções abaixo.						N	Vol./poço		Posição	ID	KPE	Água	Solução Padrão GSH	10% TCA	DTNB + GR		5 mM NADPH	Na placa	i	ii	iii	Média
58						Pontos Curva tGSH	6	15		A1–A3	Blank	0	200	0	0	0		0	Blank	0.000	0.000	0.000	0.000
59	Agitar tubos em vortex entre diluições.					Pontos Curva GSSG	7	40		B1–B3	Zero	50	115	0	10	15		10	0.00	1.852	2.095	1.952	1.966
60						Amostras GSH	5	15		C1–C3	5 µM	50	115	10	0	15		10	0.25	11.167	10.938	11.252	11.119
61	5 µL 20 mM GSSG (10%TCA)		80 µM			Amostras GSSG	5	40		D1–D3	10 µM	50	115	10	0	15		10	0.50	20.395	20.381	20.538	20.438
62	+ 1245 µL 10%TCA		80 µM							E1–E3	20 µM	50	115	10	0	15		10	1.00	37.910	38.224	38.281	38.138
63						Volume de reagente necessário (µL)		1935		F1–F3	40 µM	50	115	10	0	15		10	2.00	74.624	73.310	72.124	73.353
64	80 µL 80 µM GSSG (10% TCA)		6.4 µM			Volume a ser feito (µL)		2226		G1–G3	80 µM	50	115	10	0	15		10	4.00	149.710	144.281	146.510	146.834
65	+ 920 µL 10%TCA		6.4 µM
66					3.2 Preparando a solução					5.2.1.2 Amostras
67	Fazer diluições seriadas de 6.4 µM, 3.2 µM, 1.6 µM, 0.8 µM, 0.40 µM e 0.20 µM usando 10% TCA como solvente: 200 µL + 200 µL (10% TCA).				A solução deve ser preparada adicionando 1 (um) volume de 21 U/mL GR a 2 (dois) volumes de 4 mM DTNB.					Posição	ID	KPE	Água	Amostra	10% TCA	DTNB + GR		5 mM NADPH	(A412nm/min)*1000				tGSH (μM)	tGSH (μM)	Diluição	ID	tGSH (μM)	GSH (μM)	GSSG/tGSH
68										Posição	ID	KPE	Água	Amostra	10% TCA	DTNB + GR		5 mM NADPH	i	ii	iii	Média	Na placa	No sobrenadante	Homogeneização	ID	Na amostra	Na amostra	Na amostra
69					A concentração dos reagentes na solução deve ser de 7.00 U/mL GR e 2.67 mM DTNB.					A4–A6	Smp_1	50	115	5	5	15		10	11.000	11.000	11.000	11.000	0.249	9.979	1.11	Smp_1	11.09	10.62	4.26%
70					Em um único tubo, adicionar KPE, água milliQ e solução de GR estoque, totalizando o volume final necessário calculado no passo 3.1, conforme tabela abaixo					B4–B6	Smp_2	50	115	5	5	15		10	20.000	20.000	20.000	20.000	0.499	19.947	1.11	Smp_2	22.16	21.51	2.96%
71	1.2.4 20 mM GSH (307.32 g/mol) em 10% TCA									C4–C6	Smp_3	50	115	5	5	15		10	40.000	40.000	40.000	40.000	1.052	42.097	1.11	Smp_3	46.77	45.93	1.80%
72	Diluir alíquota em 10% TCA usando os volumes/proporções abaixo.									D4–D6	Smp_4	50	115	5	5	15		10	30.000	30.000	30.000	30.000	0.776	31.022	1.11	Smp_4	34.47	33.44	2.97%
73	Esta solução é o estoque para produzir a curva-padrão de tGSH.					KPE	Água	GR Stock	Vol. final	E4–E6	Smp_5	50	115	5	5	15		10	50.000	50.000	50.000	50.000	1.329	53.171	1.11	Smp_5	59.08	57.87	2.05%
74	Esta solução pode ser armazenada em geladeira e usada por 15 dias.					74.2	643.0	24.8	742.00	F4–F6	Smp_6	50	115	5	5	15		10	75.000	75.000	75.000	75.000	2.021	80.859	1.11	Smp_6	89.84	88.45	1.55%
75										G4–G6	Smp_7	50	115	5	5	15		10	110.000	110.000	110.000	110.000	2.991	119.621	1.11	Smp_7	132.91	131.33	1.19%
76		Peso (mg)		Vol. (µL)	Em seguida, no mesmo tubo, adicionar a solução de DTNB usando o volume mostrado abaixo.					H4–H6	Smp_8	50	115	5	5	15		10	150.000	150.000	150.000	150.000	4.098	163.920	1.11	Smp_8	182.13	177.43	2.58%
77		6.1464	-----	1000
78		5.00	-----	813.5			4 mM DTNB	1484.00
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80	1.2.4.1 GSH - Soluções-Padrão				4. Preparo das Amostras
81	Diluir solução estoque (20 mM) em 10% TCA usando os volumes/proporções abaixo.				Cada tipo de amostra pode ter requisitos de preparo diferentes, verifique o caso mais adequado para a sua amostra.
82
83	Agitar tubos em vortex entre diluições.				Geralmente, as amostras são homogeneizadas com TCA de maneira a se obter uma concentração final de TCA de 10% no homogeneizado.
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85	5 µL 20 mM GSH (10% TCA)		80 µM		Após homogeneização, as amostras são incubadas em gelo por 10 min.
86	+ 1245 µL 10% TCA		80 µM		Após incubação, são centrifugados a 10.000 x g por 10 min a 4°C.
87					O sobrenadante*, contendo GSH e GSSG, é transferido para um novo tubo.
88	Fazer diluições seriadas de 80 µM, 40 µM, 20 µM, 10 µM e 5 µM usando 10% TCA como solvente: 100 µL + 100 µL (10% TCA).				Os tubos contendo os sobrenadantes são mantidos em gelo durante todo o experimento.
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90					*Os pellets provenientes do preparo de amostra com TCA descito acima pode sem usados para medir outras variáveis de interesse, tais como os níveis de proteínas totais, proteínas carboniladas, ou alguma outra proteína para a qual haja anticorpo (WB). Para que essas análises sejam viáveis, é necessário registrar o volume de amostra que deu origem a cada pellet. No caso da medição de proteínas carboniladas, é necessário separar dois pellets, de volume conhecido, para cada amostra.
91
92	1.2.5 8 mM NADPH (833.35 g/mol) em PBS
93	Caso não haja solução pronta no -20°C ou -80°C, diluir alíquota em PBS usando os volumes/proporções abaixo.
94
95	O peso molecular do NADPH depende da forma do sal específico que se tem disponível. Verifique se o peso é o mesmo da planilha.
96
97	Uma vez descongelada a alíquota pode ser congelada novamente para uso posterior. Basta verificar a concentração novamente antes do uso.
98
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100		Peso (mg)		Vol. (µL)