1 of 25

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

Аспирантка 1 года обучения

Факультета фундаментальной медицины

Чечехина (Войнова) Елизавета Сергеевна

Москва, 2023

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

2 of 25

Aктуальность

Мезенхимные мультипотентные стромальные клетки (МСК) обеспечивают регенеративный и репаративный потенциал тканей организма взрослого человека.

Клеточное старение – процесс утраты способности к делению и ухудшение функциональных свойств клеток. В результате старения МСК происходят нарушения работы органов и тканей, развиваются возрастные заболевания.

Очень важно на клеточном уровне изучать изменения, происходящие с МСК при старении, поскольку это может помочь как в объяснении механизмов развития некоторых возраст-ассоциированных заболеваний, так и в поиске возможного их лечения.

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

3 of 25

Изменение морфологии�(клетки приобретают распластанный фенотип и теряют веретеновидную морфологию)

Основные признаки старения МСК

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

4 of 25

Увеличении экспрессии бета-галактозидазы, ассоциированной со старением

Основные признаки старения МСК

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

5 of 25

Цель: создать нейронную сеть для оценки старения культуры на уровне популяции, а также идентификации отдельных сенесцентных клеток и дальнейшего наблюдение за ними в прижизненных экспериментах в реальном времени

Задачи:

Подготовить датасет микроскопных снимков МСК в фазовом контрасте и при окраске на бета-галактозидазу при разной плотности посадки клеток
Осуществить автоматическую разметку снимков с учетом деления клеток на классы (сенесцентные и молодые)
Подобрать подходящую архитектуру сверточной нейросети
Подобрать подходящие метрики качества и гиперпараметры
Достичь высоких значений метрик

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

6 of 25

Подготовка данных

Изображения с окрашиванием на β-галактозидазу получены с помощью черно-белой камеры с применением красного фильтра.

В цветной камере окрашивание имеет голубой цвет.

Фазовый контраст

Окрашивание ядер

β-галактозидаза

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

7 of 25

Подготовка данных

Align всех изображений

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

8 of 25

Подготовка данных

Rolling ball для изображений с окраской

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

9 of 25

Подготовка данных

Автоконтрастирование изображений с окраской

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

10 of 25

Подготовка данных

Инвертирование изображений с окраской

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

11 of 25

Подготовка данных

Threshold: > 15% интенсивности, > 4 мкм

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

12 of 25

Автоматическая разметка: Cellpose 2.0

Модель, дообученная (на наших данных) на основе предобученной модели LC4

На выходе: маска в формате numpy.array.

Итого: размечено более 205 000 клеток.

IoU = 0.849

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

13 of 25

Поклассовая разметка

Клеткам, внутри масок которых оказывалось окрашивание, присваивался класс 1 (сенесцентная клетка), а клеткам, внутри масок которых отсутствовало окрашивание, присваивался класс 0 (молодая клетка).

Сенесцентные клетки

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

14 of 25

Дисбаланс классов

Число клеток

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

15 of 25

CustomImageDataset

Оригинальное изображение

Маска отдельной клетки

Вырезанное изображение отдельной клетки + метка класса

Class = 0

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

16 of 25

Разделение на train/test

Class = 0

В train и test мы поместили снимки клеток разных доноров, чтобы исключить донор-специфичность модели.

Модели, метрики качества

Модели: CustomResNet, EfficientNetB1, EfficientNetB4, EfficientNetB5, Xception. Loss-функция: бинарная кросс-энтропия. Метрики качества: ROC-AUC, precision, recall и f1-score по каждому классу, overall accuracy.

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

17 of 25

Результаты сравнения моделей

Модель	Молодые клетки			Старые клетки			Accuracy
Модель	precision	recall	f1-score	precision	recall	f1-score	Accuracy
EfficientNet-B1	0.66	0.70	0.68	0.68	0.64	0.66	0.67
EfficientNet-B4	0.69	0.90	0.78	0.86	0.59	0.70	0.75
EfficientNet-B5	0.65	0.76	0.70	0.71	0.59	0.65	0.68
CustomResNet	0.63	0.68	0.65	0.65	0.60	0.62	0.64
Xception	0.60	0.76	0.67	0.67	0.48	0.56	0.62

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

18 of 25

Fine-tuning лучшей модели

Class = 0

Модель	Молодые клетки			Старые клетки			Accuracy
Модель	precision	recall	f1-score	precision	recall	f1-score	Accuracy
EfficientNet-B4	0.81	0.82	0.82	0.82	0.80	0.81	0.814

Дообучение на weighted dataset (выше вероятность попадания клеток, в которых модель ошибалась больше всего). Подбор подходящего размера изображения.

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

19 of 25

Интерпретация работы модели

Class = 0

Интерпретация работы модели с помощью метода Grad-CAM.

Слева направо: 2 старые клетки, затем 2 молодые клетки.

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

20 of 25

Real-world example #1

Коммерческая линия иммортализованных МСК (достоверно молодые)

МСК, сенесцентность которых мы хотим оценить

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

21 of 25

Real-world example #1

2 разных культуры МСК.

Посадка в одинаковой плотности.

1 - коммерческая линия иммортализованных МСК

0 - стареющие МСК

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

22 of 25

Real-world example #2

Class = 0

Пороговое значение	precision	recall
0.32	0.95	0.42
0.88	1	0.15

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

Ответ МСК на действие гормона (флуоресцентная интервальная съемка)

23 of 25

Real-world example #2

Class = 0

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

Пороговое значение	precision	recall
0.32	0.95	0.42
0.88	1	0.15

Дифференцировка МСК в адипоциты в реальном времени (интервальная съемка на фазовом контрасте, 14 дней)

24 of 25

Нам удалось создать многофункциональный инструмент мониторинга сенесцентности как целой популяции, так и отдельных клеток в ней. Он открывает возможности для раннего обнаружения стареющих клеток в культуре, выявления индивидуальной вариабельности клеток при старении, изучения профилей их ответа на различные гормоны, а также эффективность их дифференцировки в различных направлениях.

Заключение

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence

25 of 25

Благодарности

Сотрудникам кафедры биохимии и регенеративной медицины:

Волошину Н.С.

Чечехину В.И.

Тюрину-Кузьмину П.А.

Кулебякину К.Ю.

Сотрудникам института регенеративной медицины:

Ефименко А.Ю.

Виговскому М.А.

Некоммерческому Фонду развития науки и образования "Интеллект"

Преподавателям курса “Нейронные сети и их применение в научных исследованиях”

Антюфриевой Л.А.

Васильеву А.В.

Live microscopic assessment of multipotent mesenchymal stromal cells senescence