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Aplicación tópica de análogo de amigdalina reduce inflamación y proliferación de queratinocitos en un modelo de ratón con psoriasis

Andrea Cachutt Díaz

Residente de primer año de Dermatología y Sifilografía

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INTRODUCCIÓN

Psoriasis: Enfermedad inflamatoria crónica más comunes de la piel

3% de la población mundial

La mayoría representan psoriasis “tipo placa”

Histología: Engrosamiento de epidermis por proliferación de queratinocitos y denso infiltrado dérmico de células inmunitarias

Queratinocito: Activación y reclutamiento de células inmunitarias a través de secreción de TNF-alfa e IL-23

Linfopoyetina del estroma tímico (TSLP)

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INTRODUCCIÓN

TSLP promueve respuesta inflamatoria en queratinocitos y células madres epidérmicas en etapas iniciales de psoriasis

Mediadores producidos por queratinocitos actúan sobre células inflamatorias: Citoquinas con activación y proliferación de queratinocitos

Tratamiento de psoriasis depende de gravedad

Leve-moderado: Tratamiento tópico con o sin fototerapia

Severo: Tratamiento sistémico

Productos biológicos dirigidos a bloquear TNF alfa, IL-23, IL-17A

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INTRODUCCIÓN

Agentes terapéuticos tópicos: Emolientes, queratolíticos, esteroides, análogos de vitamina D, retinoides, inmunomoduladores

Necesidad continua de tratamientos más efectivos y mejor tolerados para lesiones recalcitrantes

Amigdalina (Vitamina B17): Semillas de las frutas (Familia Rosáceas)

Antiinflamatorio

Efectos neurotróficos

Toxicidad (Ratones): >500 mg/Kg – Cianuro

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Análogos de amigdalina:

Moléculas peptidomiméticas del péptido T

Marcusson JA, et al. - Estudio clínico: Pacientes con psoriasis tratados con Péptido T – Mejora puntuación histopatológica y grosor epidérmico (50% casos)

Pérez JJ. - Modelo de xenoinjerto de piel en ratones inmunodeficientes se administró amigdalina: Mejoría de indicadores psoriásicos, inhibición de señalización de IFN-γ en queratinocitos epidérmicos in vitro.

INTRODUCCIÓN

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OBJETIVO

Evaluar la eficacia terapéutica del análogo de amigdalina (FIB-116) en un modelo de ratones con enfermedad similar a psoriasis (DKO*)

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MATERIALES Y MÉTODOS

1. Preparación de la crema:

Mezcla de fase oleosa y acuosa (75-80°C) Emulsión que se enfría a temperatura ambiente (30°C) Se añade fase de compuesto activo
Preparación de vehículo: Fase oleosa + acuosa

Fase oleosa	Fase acuosa	Fase de compuesto activo
Cera de abeja (10%) Parafina líquida (6%) Aceites minerales blancos, cera, parafina (10%) Alcohol cetílico (4%) Aceite de palma (3%) Glicéridos de lauroil (3%) Caprato de caprilato de glicerilo (6%)	EDTA Disódico (1%)	Principio activo (3%) Alcohol bencílico (1%) Éter monoetilíco de dietilenglicol (5%)

Estudio experimental

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MATERIALES Y MÉTODOS

2. Muestra:

Ratones con alelo JunB floxed y c-Jun floxed cruzados con ratones transgénicos portadores de receptor de fusión Cre recombinasa-estrógeno controlado por promotor K5 específico de queratinocitos basales

JunB^f/f c-Jun^f/fK5-Cre-ERT = DKO*

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MATERIALES Y MÉTODOS

3. Aplicación de tratamiento:

8 semanas de vida inicia administración intraperitoneal de Tamoxifeno (2 mg durante 4 días): Eliminación de alelos JunB y c-Jun en queratinocitos basales K5+

6-8 días después de Tamoxifeno: Aparición de signos de psoriasis en los oídos e inicio de crema de análogo de amigdalina (300 mcg/Kg) diariamente por 16 días

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MATERIALES Y MÉTODOS

Se reevaluaron en 2 semanas y calificaron severidad de lesiones:

0 ptos	Ausencia de inflamación y placas
1 pto	Inflamación en patas
2 ptos	Inflamación en patas y orejas
3 ptos	Inflamación en patas y placas pequeñas en orejas
4 ptos	Inflamación en patas y grandes placas en orejas
5 ptos	Inflamación y grandes placas en orejas, patas, cola, espalda

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MATERIALES Y MÉTODOS

4. Pruebas especiales:

Histología e inmunofluorescencia	Aislamiento de ARN y PCR-RT	ELISA	Cultivo de queratinocitos primarios
Secciones seriadas de oreja de ratón Tinción de H-E Ki67, K5, Involucrina, S100, Ly6b, S. aureus Microscopio de fluorescencia invertido (Nikon ® )	Trozo de oreja de ratones en diferentes condiciones Tras extracción se realizó transcripción inversa con kit Promega Análisis de PCR a través de kit de mezcla SYBR Green	Sueros sanguíneos de ratones no tratados, tratados con vehículo y ratones tratados con análogo de amigdalina Cuantificación de citoquinas solubles	Células epidérmicas de oreja y cola Separación de epidermis de la dermis a través de digestión con tripsina 0,75% (1 hora)

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MATERIALES Y MÉTODOS

5. Análisis estadístico:

Software Prism5 (GraphPad)

Prueba de la t de

Student de dos colas

ANOVA de una o

dos vías y post-test de Bonferroni

Valor de p: IC de 95%

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RESULTADOS

Aplicación tópica de FIB-116 mejora la enfermedad similar a psoriasis en ratones DKO*

p < 0.0001

n=7

n=9

Tras 20 días de inducción de enfermedad y aplicación de tratamiento

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RESULTADOS

Aplicación tópica de FIB-116 mejora la enfermedad similar a psoriasis en ratones DKO*

Secciones de oreja de ratón DKO*.

Tinción: H-E

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RESULTADOS

2. Aplicación tópica de FIB-116 disminuye proliferación epidérmica y restaura arquitectura epidérmica

Inmunofluorescencia de secciones de orejas de ratones DKO*

n=3 por grupo

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RESULTADOS

3. Reducción local y sistémica de citoquinas proinflamatorias en ratones DKO* luego de aplicación de FIB-116

Proliferación de queratinocitos es impulsada por retroalimentación entre citoquinas secretadas por células inflamatorias locales y los propios queratinocitos

n=5 por grupo

* p< 0.05 ** p < 0.01 ***p < 0.001

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RESULTADOS

4. Aplicación de FIB-116 reduce reclutamiento de neutrófilos y expresión de péptidos antimicrobianos en ratones DKO*

Reducción significativa en formación de microabscesos en ratones DKO* tratados con análogo de amigdalina

Análisis de expresión génica del tráfico de neutrófilos mediado por quimiocinas en la piel lesionada de DKO*: Ccl2, Cxcl1 y Cxcl2

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RESULTADOS

n=5 por grupo

* p< 0.05 ** p < 0.01 ***p < 0.001

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RESULTADOS

Inmunofluorescencia de piel de orejas de ratones DKO*

n=3 por grupo

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RESULTADOS

Inmunofluorescencia de piel de orejas de ratones DKO+: S. aureus

n=3 por grupo

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RESULTADOS

5. Aplicación de FIB-116 reduce expresión de citoquinas proinflamatorias y TSLP en ratones DKO*

TSLP: Media proliferación y respuesta inflamatoria de queratinocitos y células madre epidérmicas

Se añadió TSLP recombinante a queratinocitos primarios in vitro durante

3 días 24 horas más tarde se agregó FIB-116 durante 48 horas

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RESULTADOS

Inmunofluorescencia de queratinocitos primarios

n=3 por grupo

* p< 0.05

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RESULTADOS

Reducción de IL-10 (antiinflamatorio) en ratones tratados con TSLP recombinante y aumento en ratones tratados con FIB-116

* p< 0.05

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CONCLUSIONES

Redujo significativamente la enfermedad similar a la psoriasis en la piel de un modelo de ratón DKO* con efectos tóxicos bajos, incluso en altas cantidades

Redujo la producción de citoquinas proinflamatorias

Redujo la proliferación de queratinocitos y respuesta inflamatoria inducida por TSLP

Redujo reclutamiento de neutrófilos y expresión de péptidos antimicrobianos

Estos datos resaltan que el compuesto análogo de la amigdalina penetra de manera eficiente en la piel que conduce a una respuesta sistémica beneficiosa

Aplicación tópica de análogo de amigdalina (FIB-116):

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CONCLUSIONES

Estas propiedades positivas y de seguridad hacen del análogo de amigdalina (FIB-116) un candidato prometedor para ensayos preclínicos y clínicos

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Gracias por su atención

Galipán

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Gago-López N, Lagunas Arnal C, Perez JJ, Wagner EF. Topical application of an amygdalin analogue reduces inflammation and keratinocyte proliferation in a psoriasis mouse model. Exp Dermatol. 2021;30:1662–1674. https://doi.org/10.1111/exd.14390