Srovnání VCF generovaných různými software �při hodnocení variant v genech zodpovědných �za vzácné trombofilní stavy
NextGene
-oproti TVC a Ion Reporteru detekoval INDEL varianty přítomné v homopolymerních oblastech: v genu PROS1 c.1870+84delA (u pacientů 3, 4, 6, 8), c.602-23delT (u pacientů 4, 5, 6, 8, 10), c.469+25delC (u pacientů 4 a 8), c.1156-9dupT (u pacienta 10). V genu PROC c.1212delG (p.Met406TrpfsTer15) (u pacientů 3 a 9). V genu SERPINC1 detekoval u pacienta 9 variantu c.409-13_409-12delTT. Frekvence alternativních alel u těchto variant se pohybovala v rozmezí 20,6–36,9 %.
Prezence INDEL variant v homopolymerních oblastech u více pacientů ve stejném sekvenačním běhu s relativně nízkou frekvencí naznačuje, že se jedná o sekvenační artefakty
V rámci zavádění a hodnocení optimálního diagnostického přístupu založeného na vysokokapacitním sekvenování systémem Ion Torrent S5 v diagnostice vzácných trombofilních stavů – deficitu proteinu S (PS), proteinu C (PC) a antitrombinu (AT) jsme porovnávali data ze tří různých software – Torrent Suite, Ion Reporter a NextGene s cílem porovnat jejich účinnost a přesnost při analýze jednotlivých odhalených sekvenčních variant.
Pro posouzení možné patogenicity odhalených variant byl využit VarSome, databáze ClinVar, posouzení MAF, predikční softwary (PolyPhen, SIFT, aj.), PhyloP skóre aj.
�Výběr pacientů
Výběr pacientů pro NGS sekvenaci byl založen na opakovaně nízké hladině antikoagulačního proteinu detekované vhodným funkčním testem, pří vyloučení možných exogenních vlivů. Na sekvenaci bylo takto vybráno 31 pacientů.
Podíl mutací nalezených v tomto souboru viz Graf 1.
U 10 pacientů sekvenovaných v rámci jednoho běhu společně byly analyzovány varianty v genech PROS1, PROC a SERPINC1 pomocí tří různých software: Torrent Suite variantCalleru, Ion Reporteru a NextGene. U těchto pacientů detekovaly tyto software při svém základním nastavení (viz. Tab. 1) v genu PROS1 – 16, 19 a 27 variant; v genu PROC – 17, 17, 19 variant; pro gen SERPINC1 – 15, 15, 16 variant. (viz Tab. 2)
Podpořeno MZ ČR – RVO (FNOl, 00098892)
R. Vrtěl 1,2, P. Vrtěl 1,2, R. Vodicka 1,2
1) Fakultní nemocnice Olomouc, Ústav lékařské genetiky, Česká republika 2) Univerzita Palackého v Olomouci, Česká republika
V rámci výchozího projektu bylo celkem otestováno 31 pacientů – u 21 pacientů byla nalezena kauzální varianta. Mutační záchyt odpovídá 67,7%. Deficit antitrombinu 11(7) 63,6%; Deficit proteinu C 13(10) 76,9%; Deficit proteinu S 7(4) 57,1%. Nejčastěji byly odhaleny missense mutace 76%. Bylo nalezeno 6 novel variant.
Závěry z porovnání variant detekovaných třemi software – Torrent Suite (plugin TVC); Ion Reporteru a NextGene:
Všechny SW úspěšně detekovaly poškozující variantu SERPINC1:c.79T>C (p.Trp27Arg) a všechny SNV.
U INDEL variant zejména v homopolymerních oblastech jsme zaznamenali nejvíce chybně detekovaných variant u software NextGene.
Platforma Ion Torrent má vyšší míru chybovosti u INDEL ve srovnání s technologií sekvenování po syntéze, kterou využívá Illumina. Literatura uvádí chybovost rozmezí 0,46–2,4 %. Tyto nedostatky jsou odstraňovány optimalizací bioinformatické pipeline, zvýšením hloubky čtení a rovnoměrnosti pokrytí.
Z uvedeného vyplývá, že pro optimální VC je vhodné užívat především přístupy navržené výrobcem platformy (TVC a Ion Reporter).
Graf 1. Podíl mutací nalezených v souboru 31 indikovaných pacientů
Ion Reporter
-analýza se od ostatních porovnávaných software odlišovala detekcí variant v genu PROS1 c.347-47delT u pacientů 1 a 7 (frekvence alternativní alely 50,98 a 55,49 %) a c.939A>T (p.Leu313Phe) u pacientů 3 a 5 (frekvence alternativní alely 20,91 a 21,97%). Zajímavá je především prezence varianty c.347-47delT, která vykazuje frekvenci alternativní alely >50 %. Dle kontroly v IGV byla varianta přítomna u všech sledovaných pacientů v rámci daného skvenačního běhu, v genomickém prohlížeči VarSome není uvedena. Tento INDEL se nachází v oblasti bohaté na A/T má nízkou kvalitu, kterou má pro VC nejníže posazenou právě Ion Reporter, pravděpodobně se jedná o sekvenační artefakt.
Torrent Suite
- oproti porovnávaným software nalezena u pacienta 9 varianta v genu PROS1 c.1156-9_1156 s frekvencí alternativní alely 43,96 %. Stejná varianta (zapsána c.1156-9dupT), byla detekována u pacienta 10 i software NextGene s frekvencí alternativní alely 34,7 %. Jedná se o INDEL v oblasti bohaté na A/T – dle IGV přítomna u všech pacientů v daném sekvenačním běhu, není uvedena ve VarSome – s velkou pravděpodobností se jedná o sekvenační artefakt.
Porovnání VCF vytvořených z rozdílných software