2 of 20

Партнер: АО «ОХК Уралхим»

Руководитель проекта:

Самарина Лидия Сергеевна

Меньков Михаил Тимофеевич

Участники проекта:

Сидорова Анна

Вагнер Александра

Гильванов Амир

Солдатова Анастасия

Кириллова Надежда

Школьникова Софья

Адаптивная система контроля и изменения почвенных показателей �в период роста растения

3 of 20

Численность населения планеты возрастает с каждым годом и как следствие растет потребность в продуктах питания;

Применение удобрений на основе азота, фосфора и калия является наиболее распространенной стратегией для увеличения урожайности;

Азот один из самых важных компонентов для роста и развития растений и в данной работе мы исследовали его влияние на реакцию растений на засуху.

Цели устойчивого развития ООН: https://www.un.org/sustainabledevelopment/ru/hunger/

Проблемы сельского хозяйства

4 of 20

Актуальность исследований форм азотных удобрений

5 of 20

Пшеница Triticum aestivum L.

В качестве экспериментальных растений в качестве экспериментальных растений использовался коллекционный фонд ФИЦ СНЦ РАН:

Чай Camellia sinensis cv. Sochi

Гортензия Hydrangea macrophylla cv. Madame Faustin

Экспериментальные растения

6 of 20

Влажность субстрата

85-90 % - контроль

25-30 % - засуха

pH субстрата: 5.2 – 6.0.

План эксперимента

7 of 20

Гипотеза:

Гены, вовлечённые в ответ на засуху, вовлечены в азотный метаболизм

Цель:

Изучение реакции чая, гортензии и пшеницы на засуху в условиях закрытого грунта при использовании аммиачной селитры, мочевины и кальциевой селитры.

Задачи:

1)Выявить влияние различных форм азотных удобрений на содержание воды, пролина в листьях и стабильность клеточных мембран пшеницы, гортензии и чая;

2)Проанализировать ответ растений засуху при использовании разных форм азотных удобрений у пшеницы, гортензии и чая;

3)Выявить влияние разных форм азотных удобрений на экспрессию стресс-индуцируемых генов чая.

Новизна:

Будет выявлена специфика ответа на разные формы азотных удобрений у трех видов при засухе. Впервые будет исследовано влияние разных форм азотных удобрений на уровень экспрессии генов в засухе у чая. Результаты могут быть использованы для получения вывода о том, какие гены активируются в условиях засухи в азотном дефиците.

Цели и задачи

8 of 20

Относительное содержание воды (ОСВ),

относительная электропроводность

�

ОСВ (%) = [(FW-DW) / (TW-DW)] x 100

FW–свежая масса листа, TW–тургорная масса листа, DW–масса сухого листа

Источник: Yamasaki S, Dillenburg LR. 1999. Measurements of leaf relative water content in Araucaria angustifolia. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal 11(2):69-75; Источник: Baiii & Kinet, 2001, The use of the electrolyte leakage method for assessing cell membrane stability as a water stress tolerance test in durum wheat

Электропроводность = L1/L2 *100%

L1 - раствор с листьями через одну минуту

L2 - раствор с листьями спустя сутки �

Соотношение засуха/контроль

9 of 20

Анализ накопления пролина в листьях в условиях засухи

�

Источник: Будняк А.К., Шихалеев И.И., Иващенко О.Л. Модифицированная методика определения пролина в растениях. The Journal of V.N.Karazin Kharkiv National University, 2014

Соотношение пролина засуха/контроль

10 of 20

Экспериментальные растения до/после засухи

�

Пшеница T. aestivum

Гортензия H. macrophylla

Чай С. sinensis

11 of 20

Гены, включённые в исследование

Ген	Белок	Функциональная роль
DHN1	Dehydrin	Транскрипционный фактор, генетическая основа устойчивость к засухе в растениях, играет роль в защите клеток во время осмотического шока, влияет на восстановление после засухи
HSP70	Heat Shock protein	Выполняет функцию шаперона и помонает защитить клетки от неблагоприятного воздействия физиологичесих стрессов
WRKY42	WRKY	Транскрипционный фактор, участвует в накоплении абсцизовой кислоты регулирует ответ на абиотические стрессы
GS	glutamine synthetase	Биосинтез глутамина, увеличивает накопление теанина в листьях чая, отвечает за качество чайного листа. Играет центральную роль в регуляции усвоения азота растением.
TS	theanine synthetase	Катализирует биосинтез теанина , отвечает за качество чайного листа
ANR	Annetocin receptor	Транскрипционный фактор, имеет важное значение для биосинтеза катехинов в листьях, участвует в азотном метаболизме
CHS	chalcone synthase	Образование халконов, класса органических соединений, участвуют в защитных механизмах и накоплении катехинов
FLS	flavone synthase	Накопление полифенолов, участие в стрессовых реакциях в продвижении каскада MAP-киназ

12 of 20

Функциональная роль

Гены, включённые в исследование

Ген	Белок	Функциональная роль
IMPDH	IMP dehydrogenase	Фермент биосинтеза пурина , который катализирует биосинтез кофеина
C4H	trans-cinnamate 4-hydroxylase	Является вторым геном фенилпропаноидного пути, ответственного за производство различных соединений, включая лигнин. Вовлечен в азотный метаболизм
DFR	dihydroflavonol 4-reductase	Катализирует восстановление дигидрофлавонолов до лейкоантоцианидинов, которые являются прямыми предшественниками антоцианидинов.
LAR	leucoanthocyanidin reductase	Кодирует лейкоантоцианидин редуктазу, образующую флаван-3-олы, которые могут окисляться в проантоцианидины
PAL	phenylalanine ammonilyase	Кодирует фермент, который катализирует реакцию превращения L-фенилаланина в аммиак и транс-коричную кислоту.
NR	nitrate reductase	Кодирует Нитратредуктазу — один из ключевых ферментов азотного обмена. Его функция заключается в восстановлении нитрат-иона до нитрит-иона.
ASN	asparagine synthetase	Кодирует аспарагинсинтетазу- цитоплазматический фермент, который генерирует аспарагин из аспартата. Отвечает за мобилизацию азота в прорастающих семенах
AlaAT	Alanine transaminase	Кодирует аланинаминотрансферазу (ALAAT1), участвующую в катаболизме аланина во время восстановления растений после гипоксии
GOGAT	glutamale synthase	Этот фермент производит глутамат из глутамина и α-кетоглутаратаи, таким образом, наряду с глутаминсинтетазой (сокращенно GS) играет центральную роль в регуляции усвоения азота растением.

13 of 20

�

Работа проведена совместно с сотрудником НГУ (Новосибирск) Бобровских А.В.

Метаболизм азота

Метаболизм аминокислот (аланин, аспартат, глутамат)

Биосинтез флавоноидов

Реконструирована генная сеть в STRING

и процессы (gene ontology), с которыми она ассоциирована

22 узла, 36 связей

14 of 20

�

Гены метаболизма аминокислот

и азотного метаболизма

Гены биосинтеза флавоноидов

Эксперимент – ЗАСУХА (GEO NCBI #GSE124340)

Сравнение – контроли (well-watered)

Против засуха (drought-stressed)

AlaAT1	alanine aminotransferase 2-like
AMT1.2	ammonium transporter 1 member 2-like
ANRa-ANR2	anthocyanidin reductase ((2S)-flavan-3-ol-forming)
ANRb-ANR1	anthocyanidin reductase ((2S)-flavan-3-ol-forming)-like
ANS_b	leucoanthocyanidin dioxygenase-like
ASN1	asparagine synthetase 1
ASN2	asparagine synthetase 2
C4H	trans-cinnamate 4-hydroxylase
CHS	chalcone synthase
DFRb1	dihydroflavonol 4-reductase-like
F3'5'H_a	flavonoid 3',5'-hydroxylase 2-like
FLS	flavonol synthase/flavanone 3-hydroxylase-like
GDH_a	glutamate dehydrogenase A
GDH2	glutamate dehydrogenase 2-like
GOGAT_a	chloroplastic NADH-dependent glutamate synthase 1
GS1.2	glutamine synthetase nodule isozyme-like
GS2	glutamine synthetase leaf isozyme, chloroplastic
LAR	leucoanthocyanidin reductase-like
NR	nitrate reductase [NADH]-like
NRT2.4	high affinity nitrate transporter 2.4-like
PAL_a	phenylalanine ammonia-lyase-like
TSI	clone 1 glutamine synthetase mRNA

экспрессия относительно

контроля

>10

Работа проведена совместно с сотрудником НГУ (Новосибирск) Бобровских А.В.

Выявлен характер экспрессии ряда генов в ответ на засуху

с использованием программы GEO NCBI

Анализируемые гены :

15 of 20

�

Метод: CTAB

Навеска листа около 150 мг

Метод: CTAB

Навеска листа около 50 мг

Метод: гуанидин тиоцианат-фенол-хлорофорная экстракция

Навеска листа около 50мг

Выделена РНК для обратной транскрипции и

анализа экспрессии генов методом qRT-PCR

Источник: DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. A rapid DNA isolation procedure forsmall quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin,v.19, 1987.

Концентрации 700-1500 нг/мкл

А260/А280 = 1,8-2,0

А260/А230 = 2,1-2,4

Концентрации 400-700 нг/мкл

А260/А280 = 1,8-2,0

А260/А230 = 2,1-2,4

Концентрации 200-300 нг/мкл

А260/А280 = 1,6-1,9

А260/А230 = 1,6-2,0

16 of 20

�

Наибольший уровень экспрессии наблюдался у генов DHN1, HSP70, FLS, и ANR в варианте с мочевиной.

Анализ экспрессии генов в засухе методом qRT-PCR

Относительный уровень экспрессии генов чая в засухе

методом qRT-PCR

Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Analysis of relative gene expression data using realtime

quantitative PCR and the 2􀀀11CT method. Methods 25(4):402408.

ANR (Anthocyanidin reductase) принимает участие в усвоении растением нитратов. Белки ANR имеют важное значение для биосинтеза катехинов.

HSP70 (heat shock protein) – кодирует белки теплового шока, защищая макромолекулы от повреждений свободными радикалами.

DHN1 (Dehydrin) кодируют белки дегидрины, играющие важную роль в защите мембран во время осмотического стресса. По литературным данным, растения, в которых данный ген обладает повышенной экспрессией, лучше переносят засуху.

FLS (Flavone synthase). Флавонолсинтаза – фермент, катализирующий синтез флавоноидов, которые относятся к классу полифенолов. Накопление полифенолов связано с показателем качества и устойчивости чая.

17 of 20

�

Полученные результаты будут важны для оптимизации системы минеральных удобрений сельскохозяйственных и декоративных культур.

Масштабирование и социальный эффект

18 of 20

�

Выводы

Реакция на стресс, а именно показатели содержания пролина, относительного содержания воды и электропроводности специфичны для чая, гортензии и пшеницы.
На основе биохимических данных для пшеницы T.aestivum наилучший вариант удобрений – мочевина, для гортензии H.macrophylla – мочевина и аммиачная селитра, а для чая С.sinensis – мочевина.
Между вариантами азота выявлены различия в экспрессии генов DHN1, HSP70 и ANR, FLS которые наиболее сильно экспрессировались в варианте с применением мочевины в условиях засухи у чая. Это показывает более сильный защитный эффект от засухи в этом варианте.

19 of 20