1 of 39

Yeni Nesil Dizileme Teknolojilerinde Varyant Çağırma

Emrah Kırdök

2 of 39

3 of 39

4 of 39

Yeni Nesil Dizileme Teknolojileri?

5 of 39

Yeni Nesil Dizileme Teknolojileri?

6 of 39

FastQ dosyaları

7 of 39

DNA kütüphanesi kalite kontrolü

8 of 39

Adaptör içeriği

  • Eğer DNA dizilerinde adaptörler varsa, bu analizlerimizi zorlaştırır
  • Hata bile olabilir
    • AdaptorRemoval
    • trimmomatic

9 of 39

10 of 39

Referans genom ile hizalama

  • Referans genomu indeksleme (bwa index)
  • DNA dizlerini referans genoma hizalama (bwa aln)
  • Dizi hizlama dosyası (sequence alignment map)
  • İkili dizi hizalama dosyası (bam)

11 of 39

Referans genom hizalama

12 of 39

Hizalama

  • Referans ile DNA okuması arasındaki en iyi eşleşmeyi bul
  • Zorluklar
    • DNA okumalarındaki hatalar (okuma kalitesi)
    • DNA kütüphanelerindeki teknik sorunlar
    • Tekrar bölgeleri (homolog bölgeler, tekrarlar)
    • Homopolimerler

​

13 of 39

DNA hizalama algoritmaları

14 of 39

Dizi hizalama dosyaları

15 of 39

16 of 39

Hizalamadan sonra

  • PCR duplikasyonları sorun teşkil edebilir
  • Bazı bölgeleri yeniden hizalayabiliriz (local realignment)
  • Kalite değerleri kalibrasyonu

​

17 of 39

Hizalama kalitesi

  • Eğer, bir DNA dizisi birden fazla bölgeye hizalanmışsa?
    • Tekrarlı dizileri yüzünden
    • Homopolimer bölgeler (düşük karmaşıklık)
    • Hatalar ve boşluklar
    • MQ (hizalama kalitesi skoru)

​

18 of 39

Optik PCR duplikasyonları

19 of 39

PCR duplikasyonları

  • Birbirinin eşdeğeri olan okumaları çıkartalım
  • Aynı bölgeye hizalanan diziler

20 of 39

Bölgesel yeniden hizalama

21 of 39

22 of 39

23 of 39

24 of 39

Varyant Çağırma

  • Varyant : Bir sonuç
    • Bir pozisyonda, referans genomdan farklı olan bölgeler
    • TNP
    • Kısa INDEL
    • Yapısal varyant

25 of 39

Yapısal varyant

  • Farklı tipte kromozomal değişimleri
    • INDEL
    • Translokasyonlar
    • Inversiyon

26 of 39

27 of 39

28 of 39

29 of 39

TNP çağırma

  • Tek nükleotid polimorfizmi
    • Bir pozisyona hizalanmış bazlara bak, ve farklılığı tespit et
  • Düşünülmesi gereken faktörler:
    • Baz okuma kaliteleri
    • INDEL bölgelere olan yakınlık
    • O bölgeye hizalanmış bazların hizalama kaliteleri
    • Dizi uzunluğu

​

30 of 39

31 of 39

INDEL çağırma

32 of 39

33 of 39

34 of 39

Variant Call Format (VCF)

  • DNA polimorfizm verisini saklamak için standart bir format
    • TNP
    • INDEL
    • Yapısal varyatlar
  • Indekslenerek, daha hızlı erişim sağlanabilir

35 of 39

VCF formatı

36 of 39

37 of 39

Peki hangi SNP’ler gerçek pozitif?

  • Filtreleme kriterleri
    • Baz kalitesi (20)
    • Okuma derinliği
    • Hizalama derinliği (50 – 60)
    • İleri veya geri iplik
    • TNP yoğunluğu
    • INDEL yakınlığı

38 of 39

Varyant anotasyonu

  • Bu varyantların nerede olduklarını biliyoruz
  • Peki bu varyantları anote edebilir miyiz?
    • SnpEFF: Varyant anotasyonu
    • Bir genom anotasyon dosyası varlığında, bu varyantları daha iyi anlayabiliriz
    • Mesela hangi genlerde?
    • Amino asit değişimleri oluşturuyor mu?

39 of 39