2 of 10

Актуальність

Drosophila melanogaster - її невеликі розміри, короткий життєвий цикл, мала кількість хромосом (2n=8). Все це дозволяє використовувати дрозофілу як модельний організм для молекулярно-генетичних і фізіолого-біохімічних досліджень.

Отримання високоочищених нуклеїнових кислот є першим етапом у молекулярно-генетичних дослідженнях.

У зв’язку з тим, що інсують різноманітні способи виділення і очищення НК, вибір базується на цілях ,ресурсах дослідника і меті подальшого використання.

3 of 10

Мета роботи

Метою роботи є апробація методу екстракції ДНК зі СТАВ з Drosophila melanogaster.

4 of 10

Характеристика CTAB методу

Метод найбільш всього підходить для екстракції ДНК з рослинних клітин, оскільки властивості буферу СТАВ (бромистий цетилтриметиламоній) особливо зручні для видалення полісахаридів і поліфенолів , які мають негативний вплив на чистоту ДНК.

Метод ізолювання ДНК із використанням СТАВ включає в себе стадії лізису, очистки і осадження.

5 of 10

Матеріали і методи

9 ліній Drosophila melanogaster з колекції ОНУ імені І. І. Мечникова.
Метод екстракції ДНК з використанням лізуючого буферу із 2% СТАВ.
Спектрофотометричний аналіз зразків ДНК на NanoDrop2000 (Thermo Scientific, США).
ПЛР з ампліфікацією.
Електрофорез у поліакриламідному гелі.

6 of 10

Матеріали і методи

Виконували екстракцію за протоколом

Табл. 1. Протокол екстракції ДНК зі CTAB буфером

7 of 10

Результати спектрофотометричного аналізу

Результат кількісного аналізу зразків виділеної ДНК на спектрофотометрі NanoDrop2000 при довжині хвиль 230, 260, 280 нм.

Порівнявши відношення оптичних щільностей при

довжині хвиль 260/280 та 260/230 , зробили

висновок про чистоту зразків від домішок

Табл. 2. Оптична щільність зразків при довжині хвиль 230, 260, 280 нм.

1 од. А260 у випадку з дезоксирибонуклеїновою кислотою дорівнює 50 ng/uL ДНК , що ми і бачимо в стовпчику з концентрацією. Середнє 2.89 , максимальне 7.324, що свідчить про достатню концентрацію нуклеїнових кислот для подальшого використання в ПЛР.

А280 вказує на концентрацію білків у розчині. Чим менше значення тим чистіший зразок. Співвідношення А260\280 використовується для оцінки забруднення зразка білками, оскільки білки поглинають світло на довжині хвилі 280нм , для чистої ДНК зазвичай норма ~1.80. В наших зразках ми маємо середнє 1.50 , а найбільше 2.15 це показує що білкове забруднення в межах норми.["Assessment of Nucleic Acid Purity" (PDF). Thermo Scientific. Retrieved 2016-09-28]

Значення А230 вказує на концентрацію фенолів , кислих солей . Співвідношення А260\230 показує на забруднення органічними речовинами , для чистої ДНК норма ~2.00 , в нашому випадку ми маємо середнє 2.224 , максимальне 2.35. Показник завищений і відхиляється від норми на 11.2% , але нормальне відхилення в межах 20% тому зразки відносно чисті від органічних речовин які могли залишитись після екстракції і фіксації ДНК.[Sambrook&Rassel(2001)]

8 of 10

Результати гель-електрофорезу

Результат ампліфікації отриманих НК у ПЛР з

iPBS праймером 2080

CAGACGGCGCCA

Tm54.6

Рис. 1. Електрофореграма отриманої ДНК

9 of 10

Висновок

Емпіричним шляхом доведено що метод СТАВ підходить для екстракції ДНК з індивідуальних особин Drosophila melanogaster.
Отримані результати відповідають стандартам необхідним для подальшого використання у ПЛР.
Метод з 2% СТАВ можно використовувати не тільки для екстракції ДНК з рослин, а і для екстракції ДНК з тваринних клітин. Це доведено чистотою розчину і концентрацією нуклеїнових кислот у отриманих зразках.

1 of 10