ГІБРИДОМИ І ГІБРИДОМНІ ТЕХНОЛОГІЇ�HYBRIDOMES AND HYBRIDOME TECHNOLOGIES

Дослідження мієлом призвело до відкриття моноклональних антитіл

​

• У 1970-х роках вивчення мієлом показало, що всі ракові В-клітини виробляють лише один тип антитіл. Ці антитіла було названо моноклональними, т.к. вони взаємодіяли лише з одним епітопом (антигенною детермінантою). Це було використано для вивчення структури антитіл.

ОТРИМАННЯ МОНОКЛОНАЛЬНИХ АНТИТІЛ

• Георг Келер та Цезар Мільштейн розробили технологію отримання гібридом шляхом злиття мишачих лімфоцитів та мієломних клітин. Це дозволило отримувати моноклональні антитіла в необмежених кількостях.

За це відкриття вони разом із Єрне у 1984 році здобули нобелівську премію в галузі медицини та фізіології.

ОТРИМАННЯ МОНОКЛОНАЛЬНИХ АНТИТІЛ

Гібридома - гібридна клітинна лінія, отримана в результаті злиття клітин двох видів: здатних до утворення антитіл B-лімфоцитів, отриманих із селезінки імунізованої тварини (найчастіше миші), та ракових клітин мієломи. Злиття клітин проводиться за допомогою порушуючого мембрани агента, такого, як поліетиленгліколь або вірус Сендай.

Основні етапи одержання гібридом

Імунізація мишей

Виділення спленоцитів – продуцентів антитіл

Селекція мієломних клітин не продукуючих антитіла

Злиття спленоцитів і мієломних клітин для одержання гібридом

Селекція гібридом, продукуючих цільові антитіла у високих титрах

Виробництво моноклональних антитіл у великих кількостях

�Основні етапи одержання гібридом �

В клітини

​

​

• В клітини містять ген гіпоксантин-гуанін-фосфорибозилтрансферази (ГГФТ)
• Вони не можуть зростати нескінченно через обмежений життєвий цикл. Швидко гинуть.

Мієломна клітина

• Не містить ген гіпоксантин-гуанін-фосфорибозилтрансферази (ГГФТ)
• Не синтезує власних антитіл
• Практично безсмертна

Після злиття клітини протягом 10-14 днів підтримують у середовищі, що містить ГАТ (гіпоксантин, аміноптерин та тимідин). Аміноптерин блокує синтез нуклеотидів, тому клітини материнської мієломи гинуть. На відміну від мієломи, гібридні клітини та В-лімфоцити, що мають ген ГГФТ, виживають за рахунок використання гіпоксантину як джерела пуринів, але тривалість життя звичайних лімфоцитів обмежена, і через кілька тижнів у культурі залишаються лише клітини гібридоми.

Одержання Mab in vitro

0,15 мг в 1 мл

Одержання Mab in vivo

10 мг в 1 мл

Клітини яечника китайського хомячка CHO

Дріджи Saccharomyces cerevisiae

Кишкова паличка Escherichia coli

Еволюція моноклональних антитіл

Еволюція моноклональних антитіл

Зниження імуногенності

Мишачі

Хімерні

Гуманізовані

Людські

Області застосування моноклональних антитіл

• Таргетна терапія
• ідентифікація субпопуляцій лімфоцитів людини
• виснаження клітинних популяцій
• виділення клітин
• встановлення функцій молекул клітинної поверхні
• визначення групи крові
• діагностика пухлин та локалізація пухлин
• імунорадіометричний аналіз
• аналіз складних сумішей антигенів
• аналіз ембріонального розвитку
• аналіз імунної відповіді
• штучні ферменти.

Виробництво антитіл та інших рекомбінантних білків складається з двох великих стадій: upstream process (USP), що включає усі стадії від розморожування пробирки з клоном продуцентом до одержання над осадової рідини по закінченні культивування; та downstream process (DSP) – процес виділення та очистки продукту. �

Зовнішний вигляд промислового біореактору

 «Біобанки». Клітинне сховище ATCC (США).

Filaments and Tubules of the Cytoskeleton

Microfilaments

Microtubules

Intermediate Filaments

(Fig 1-20, ESB 1998)

Anti-actin Antibody with bound rhodamine (red) fluorescent label

Anti-tubulin antibody with bound fluorescein (green) label

Anti-vimentin? Antibody with bound blue fluorescent label