TP 5 - b

Programando en

biología

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Experimento

• Reacción enzima - sustrato

Fluorescentes

No hay reacción ⇒

No hay fluorescencia

Medir la fluorescencia a lo largo del tiempo en presencia o no de inhibidores

Experimento

22 compuestos

Placa de 384 wells

16 concentraciones

Mediciones a 4 tiempos (cada 5 minutos)

Filtermax

Experimento: conceptos

IC50: Concentración de inhibidor en la que la velocidad de reacción es un 50% menor que la velocidad de reacción base

Velocidad de reacción base:

Variación de la señal de fluorescencia en función del tiempo, en condiciones normales (sin inhibidor)

Actividad: Relación entre la velocidad de reacción y la velocidad de reacción base

Inhibidor perfecto = Actividad ~ 0

Experimentos: conceptos

Concentraciones muy bajas, no hay efecto sobre la actividad enzimática

Concentraciones muy altas, la enzima está saturada de inhibidor

IC₅₀= Concentración de inhibidor para la cual la actividad enzimática decae un 50%

¿Cuál es el mejor inhibidor?

(Logaritmo de la concentración)

(Actividad)

Inhibidor perfecto

¿Qué hay que hacer?

Calcular velocidad de reacción

Calcular IC50

Conocer el archivo

Limpiar y parsear el archivo

Agregar información

Abrir 00_datos_filtermax.txt

Comparar los datos con la planilla del experimento

Reorganizar los datos

Eliminar filas que impidan la lectura

Agregar información de compuestos y concentraciones

Convertir los tiempos de string a número

Reemplazar con los datos del tp

Entender el script de la guía

Opcional!

Obtener gráficos de actividad y tabla con IC50

Conclusiones del experimento

Resoluciones

Paso 1: Familiarizarnos con el archivo 00_datos_filtermax.txt

1) ¿Se parece un poco a algún .csv (columnas separadas por comas) o .tsv (columnas separadas por tabs) que hayan visto antes? ¿Que diferencias tiene? Teniendo en cuenta esas diferencias y considerando que vamos a querer leerlo como una tabla en R ¿Les parece que hay filas que están de más?

• Las líneas 2 a 6 parecen un tsv, tenemos que sacar las líneas 1, 7, 8 y 9

Resoluciones

Paso 1: Familiarizarnos con el archivo 00_datos_filtermax.txt

2) Mirando el archivo y la planilla del experimento:

• ¿Qué hay en la celda A1?�Compuesto Umbrella1 200 µM (planilla) , los 4 tiempos (en el tsv)
• ¿Qué posiciones contienen las diferentes diluciones del compuesto "Umbrella2"?�La columna 2. A2, B2, …, P2
• ¿Cuántos datos hay para cada dilución del compuesto "Umbrella2"? ¿Por qué?�4 datos para cada dilución (son los 4 tiempos)

Resoluciones

Paso 1: Familiarizarnos con el archivo 00_datos_filtermax.txt

3) Ahora abra el archivo en una Hoja de Cálculo. Al final de cada placa hay varias celdas sin datos. ¿Hay algo en la planilla del experimento que explique por qué pasa esto?

Las últimas dos columnas están vacías (no tienen compuesto)

Resoluciones

Paso 2: Limpiar y parsear el archivo

Si bien este paso es importante, también es bastante específico a la salida del FilterMax F5. Por esta razón les vamos a dar el archivo ya parseado para que pasemos directamente al análisis de datos más general. Este es el archivo 02_datos_filtermax_parseados.tsv que se encuentra en sus materiales de trabajo.

Quiero pasar del txt a una tabla con la siguiente estructura

Resoluciones

Paso 2: Limpiar y parsear el archivo

1) Abran el archivo 02_datos_filtermax_parseados.tsv con el Editor de Texto y vean la columna signal. ¿Qué piensan que significan los NA en esa columna?

• Son las columnas donde no se realizó ningún experimento, por ende no había valores de fluorescencia para medir.

Resoluciones

Paso 3: Agregar la información que necesito

• A qué combinación de compuesto + concentración corresponde cada valor de señal+tiempo
• Tiempo medido en segundos totales (variable numérica)

Ejercicio - Paso 3

Resoluciones

Paso 4: Calcular la velocidad de reacción

Ejercicio - Paso 4

Resoluciones

Paso 5: Calcular IC50 y graficar

Eje X: Logaritmo de la concentración del compuesto (en µM)

Eje y: Actividad de la enzima en presencia de los distintos compuestos (velocidad de reacción/velocidad de reacción base)

IC₅₀= Concentración de inhibidor para la cual la actividad enzimática decae un 50%

Resoluciones

Paso 5: Calcular IC50 y graficar

Eje X: Logaritmo de la concentración del compuesto (en µM)

Eje y: Actividad de la enzima en presencia de los distintos compuestos (velocidad de reacción/velocidad de reacción base)

IC₅₀= Concentración de inhibidor para la cual la actividad enzimática decae un 50%

Buscar en internet:

• Cómo se calcula el máximo de los elementos de un vector de números en R�max()
• Cómo se calcula el mínimo de los elementos de un vector de números en R�min()
• Cómo se calcula el promedio de los elementos de un vector de números en R�mean()
• Cómo se redondea los decimales de un número en R�round(x, digits = 2)

Resoluciones

Ejercicio - Paso 5

Resoluciones

Inhibición a bajas concentraciones

Inhibición a altas concentraciones

No hay inhibición

Resoluciones

Paso 6 - Conclusiones

• ¿Por qué hay casos donde el IC 50 dió NA?

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El IC₅₀ da NA cuando la curva nunca alcanza el 50% de actividad. Esto pasa en dos situaciones:

• Cuando el compuesto ya inhibe casi todo desde concentraciones muy bajas (la curva arranca por debajo de 0.5).
• Cuando el compuesto no inhibe lo suficiente y nunca llega a reducir la actividad al 50%, sin importar cuánta concentración se use.

¿Cuál es un buen inhibidor y cuál no?

Resoluciones

Paso 6 - Conclusiones

• En base a los plots obtenidos, ¿Les parecen suficientes nuestros datos para estar seguros de los IC 50 calculados? ¿Cuál es un compuesto donde están bastantes seguros de su IC 50? ¿Cuál es un compuesto donde desconfían del IC 50 calculado?

Para la mayoría de los compuestos parecen faltar datos.

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Confío en el IC50?

Resoluciones

Paso 6 - Conclusiones

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​

Confío en el IC50?

Resoluciones

Paso 6 - Conclusiones

• ¿Qué experimentos harían para tener la curva completa en "Umbrella1"? ¿Y en "Umbrella8"?

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Mayores concentraciones

Menores concentraciones

Menores concentraciones

Resoluciones

Paso 6 - Conclusiones

• En base a lo observado, nombren dos o tres compuestos que recomendarían para inhibir a la enzima Z. ¿Por qué los eligieron?

Resoluciones

Paso 6 - Conclusiones

• En base a lo observado, nombren dos o tres compuestos que recomendarían para inhibir a la enzima Z. ¿Por qué los eligieron?

No hay actividad enzimática en ninguna concentración

La actividad enzimática es muy baja a bajas concentraciones de inhibidor

Resoluciones

Paso 6 - Conclusiones

• En base a lo observado, nombren dos o tres compuestos que recomendarían para inhibir a la enzima Z. ¿Por qué los eligieron?

No hay actividad enzimática a concentraciones medias/altas de inhibidor