МІКРОБІОЛОГІЯ

ЛЕКЦІЯ 15

АНТИБІОТИКИ

МІКРОБНІ БІОТЕХНОЛОГІЇ

1

2

Антибіотики

– органічні сполуки мікробного, рослин-ного чи тваринного походження та їх синтетичні аналоги, які здатні в невеликих концентраціях гальмувати ріст чи повністю знешкоджувати чутливі до них мікроор-ганізми, клітини рослин і тварин.

3

Пеніцилін (бензилпеніцилін) — перший з відкритих антибіотиків (бензилпеніцилін) — перший з відкритих антибіотиків подібного хімічного складу (пеніцилінів). Ядро молекули — 6-амінопеніциланова кислота (6-АПК) — гетероциклічна сполука, яка складається з чотиричленного β-лактамного та п'ятичленного тіазолідинового кілець. Похідні пеніциліну різняться тільки характером замісника R.

4

Будова виділених пеніцилінів. Червона стрілка (верхня панель) вказує на місце в межах b-лактамного кільця, яке розщеплюється більшістю β-лактамаз, ферментів, які руйнують пеніцилін та інші β-лактамні антибіотики. Хоча N-ацильна група (блакитне затінення) залежить від різних пеніцилінових препаратів, усі пеніциліни мають спільне ядро, що складається з β-лактамного кільця та тіазолідинового кільця. Тоді як пеніцилін G необхідно вводити ін’єкційно, більшість кислотостійких пеніцилінів можна вводити перорально.(виняток - карбеніцилін).

5

Стрептоміцин — антибіотик — антибіотик групи аміноглікозидів.

В 1943 році дослідники на чолі з З. А. Ваксманом. А. Ваксманом, виділили активну речовину під назвою стрептоміцин. Пізніше цей препарат почали використовувати для лікування туберкульозу. А в 1949 році З. А. Ваксману вдалося налагодити масове виробництво цього препарату.

В 1952 році З. А. Ваксман отримав Нобелівську премію «…за відкриття стрептоміцину, першого антибіотика, ефективного проти туберкульозу».

Streptomyces globisporus 

Аміноглікозиди - це антибіотики, які пригнічують трансляцію на 30S (мала) субодиниці рибосоми. Аміноглікозиди містять аміноцукри, з’єднані глікозидними зв’язками, а клінічно корисні приклади включають стрептоміцин (виробляється бактерією Streptomyces griseus), канаміцин, неоміцин і гентаміцин. Ці антибіотики широкого спектру дії корисні для лікування інфекцій, викликаних грамнегативними бактеріями, але через токсичність для організму ефекти, які включають пошкодження нирок і слуху, використання аміноглікозидів зменшується після розробки напівсинтетичних пеніцилінів і тетрациклінів. За винятком гентаміцину, який зазвичай використовується для боротьби з інфекціями Pseudomonas, і неоміцину, який використовується в місцевих мазях з антибіотиками, аміноглікозиди, як правило, призначаються лише тоді, коли інші антибіотики не дають результатів.

6

Тетрациклін

Тетрациклін (лат. Tetracyclinum) — антибіотик бактеріостатичної дії. Один з перших антимікробних препаратів, вперше був отриманий у 40-х роках ХХ сторіччя. У природі продукується актинобактерією Streptomyces aurefaciens.

Як і аміноглікозидні антибіотики, тетрацикліни заважають функції субодиниці 30S рибосоми. Тетрацикліни є антибіотики широкого спектру дії, що виробляються кількома видами Streptomyces, і вони пригнічують більшість клінічно значущих грампозитивних і грамнегативних бактерій. Основна структура тетрацикліну складається з aнафтаценової кільцевої системи, та бічних ланцюгів (природні або синтетичні) до різних кілець, які утворюють новий тетрацикліновий аналог. Лікарі застерігаються від призначення тетрациклінів вагітним жінкам і маленьким дітям, оскільки вони зв'язують кальцій у кістках і зубах, послаблюючи їх і викликаючи їх постійне забарвлення. Тетрацикліни широко використовуються у ветеринарії, але в деяких країнах вони регулярно використовуються у здорових тварин як харчові добавки для придушення росту патогенів у домашньої птиці та свиней.

7

Еритроміцин — антибіотик з групи макролідів для перорального, парентерального та місцевого застосування. Він є природним 14-членним макролідним антибіотиком і першим представником класу макролідів.  Еритроміцин уперше отриманий у 1952 році із Streptomyces erythreus

Макролідні антибіотики пригнічують трансляцію, націлюючись на 50S (велика субодиниця) бактеріальної рибосоми. Їх основна структура містить лактонне кільце, пов’язане з цукрами, і варіації цих компонентів призводять до різноманітності макролідних антибіотиків. На макроліди припадає близько 12% світового виробництва антибіотиків і включають, наприклад, еритроміцин (виробляється Streptomyces erythreus), кларитроміцин і азитроміцин. Часткове пригнічення синтезу білка еритроміцином, зокрема, призводить до переважної трансляції одних білків і обмежує трансляцію інших, що призводить до дисбалансу в протеомі та потенційно порушує метаболічні функції на всіх рівнях. Часто використовується клінічно у пацієнтів з алергією на пеніцилін або інші β-лактамні антибіотики, еритроміцин особливо корисний для лікування легіонельозу.

8

Гентаміци́н — природний антибіотик — природний антибіотик з групи аміноглікозидів. Препарат є комплексом антибіотиків, що продукуються Micromonospora purpurea. Гентаміцин належить до аміноглікозидів ІІ покоління і застосовується парентерально. Гентаміцин є антибіотиком групи аміноглікозидів з широким спектром дії. Механізм дії пов’язаний з інгібуванням рибосомальних субодиниць 30S. Тести in vitro підтверджують його активність відносно різних видів грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів. 

9

Тобраміцин — природний антибіотик — природний антибіотик з групи аміноглікозидів — природний антибіотик з групи аміноглікозидів III покоління для парентерального та місцевого застосування. Вироблення препарату передбачає використання продуктів життєдіяльності Streptomyces tenebrarius.

Хінолони — група синтетичних антибіотиків — група синтетичних антибіотиків, що є похідними 4-хінолону — група синтетичних антибіотиків, що є похідними 4-хінолону і мають в своєму складі піперазиновий цикл. Частиною групи хінолонів є фторхінолони — група синтетичних антибіотиків, що є похідними 4-хінолону і мають в своєму складі піперазиновий цикл. Частиною групи хінолонів є фторхінолони, що мають у своєму складі атоми фтору — група синтетичних антибіотиків, що є похідними 4-хінолону і мають в своєму складі піперазиновий цикл. Частиною групи хінолонів є фторхінолони, що мають у своєму складі атоми фтору. Першим препаратом групи, що уперше застосований у клінічній практиці у 1962 році, є налідиксова кислота

Поліміксини (циклічні поліпептиди) — група антибіотиків, побудованих із циклічного пептиду і довгого гідрофобного хвоста. Вони руйнують структуру бактеріальної клітинної мембрани діючи на її фосфоліпіди. Синтезуються нерибосомальними білоксинтезуючими системами Грам-позитивних бактерій, наприклад Paenibacillus polymyxa

Біологічна роль антибіотиків. Продуценти антибіотиків, класифікація антибіотиків.

10

11

Класифікація антибіотиків за молекулярною структурою

12

13

14

15

Мікроорганізми - продуценти антибіотиків�-плісеневі гриби (Aspergillus, Penicillium, Сephalosporium)�-актиноміцети (Streptomyces)�-баkтерії (Bacillus)�

За біологічною дією антибіотики поділяються на

• Антибактеріальні (пеніцилін, еритроміцин, олеандроміцин, карбоміцин, тетрациклін,неоміцин, стрептоміцин, поліміксин)
• антифунгальні (ністатин, леворін, клотримазол)
• протипухлинні (актиноміцин,мітоміцин С)
• противірусні

16

17

18

Мішені окремих антибіотиків

(виділено червоним жирним шрифтом)

19

Механізми дії основних антибактеріальних засобів. Агенти класифікуються відповідно до їх цільових структур убактеріальна клітина. ТГФ, тетрагідрофолат; ДГФ, дигідрофолат; ПАБК, п-амінобензойна кислота.

20

Механізми антибіотикорезистентності. Пеніцилін (β-лактамний антибіотик) використовується для ілюстрації механізмів модифікації мішені (модифікований порин), інактивації антибіотика (β-лактамаза), ефлюксного насоса та метаболічного обходу (альтернативний пеніцилінзв’язуючий білок). Гени ефлюксних насосів і ферментів  β-лактамази можуть бути плазмідними або хромосомно кодуються, тоді як альтернативний пеніцилінзв’язуючий білок кодується тільки на хромосомі. PBP: білок, що зв'язує пеніцилін. Механізми опору дії антибіотиків виділено зеленим.

Вставка: електронна мікрофотографія помпи викачування антибіотика (ArcAB-TolC система з Escherichia coli), розташована на ілюстрації грамнегативної клітини.

21

Мішені деяких протигрибкових засобів. Традиційні антибактеріальні засоби загалом неефективні, оскільки гриби є еукаріотичними клітинами. Клітинна стінка та ергостерин (присутній у цитоплазматичній мембрані) грибкових клітин є хорошими селективними мішенями, оскільки вони є унікальними структурами, яких немає в клітинах-господарях хребетних.

Методи вивчення антагоністичної активності антибіотиків та чутливості мікроорганізмів до антибіотиків

22

23

24

Визначення антагоністичної активності при пошуку продуцентів

25

Поширення резистентності до антибіотиків

26

27

Виникнення мультирезистентності Neisseria gonorrhoeae. Стійкість до пеніциліну розвинулася у 1980-х роках до такої міри, що вже він не міг бути рекомендований для лікування гонореї, при цьому ципрофлоксацин, хінолон, стали застосовувати. На початку 2000-х років виникла стійкість до ципрофлоксацину, замінили на цефтріаксон. Сучасні рекомендації щодо лікування гонореї: комбінація цефтріаксону з азитроміцином.

28

Щороку в другій декаді листопада проводиться Всесвітній день обізнаності громадськості про проблему стійкості до антимікробних препаратів щоб не допустити подальшого розвитку резистентності мікроорганізмів до антибіотиків!!!

ПРОПОЗИЦІЯ

Провести роз'яснювальну лекцію своїм рідним або сусідам про цю проблему та записати відео замість реферату

​

Прикладна мікробіологія

Мікробні біотехнології

– наука про важливі мікробіологічні процеси та їх практичне використання для отримання бажаних мікроорганізмів, біомаси та корисних продуктів їх життєдіяльності для промисловості, сільського господарства, екології та медицини. 

Біотехнології поділяють за кольорами:

Зелені, наприклад, використовують рослинні організми.

Білі технології використовують у всіляких промислових процесах. Вони роблять виробництво доступнішим і безпечнішим для природи.

Блакитні технології передбачають участь морських і океанських мікроорганізмів. Так, карагінан, який добувають з морських водоростей, слугує сировиною для виготовлення гідрогелевих патчів, без яких сьогодні не можна уявити світ, і надає приємної текстури крему.

Червоні біотехнології зазвичай стосуються здоров’я та медицини (наприклад, без них неможливо отримувати інсулін для хворих на діабет). Вони ж дають змогу реконструювати шкіру, створювати штучний епідерміс, щоб тестувати засоби щодо безпеки й ефективності.

29

Переваги використання мікроорганізмів як об’єктів біотехнології

1. Пластичність метаболізму мікроорганізмів та їх здатність до адаптації.

Лише мікроорганізми здатні змінювати напрямок метаболізму під впливом умов культивування або внаслідок штучної перебудови спадкових структур самої клітини.

​

2. Мікроорганізми у сотні разів продуктивніші за тварини та рослини, що обумовлює високий вихід цільового продукту.

​

3. Простота культивування мікроорганізмів, їх технологічність.

​

4. Різноманітні методи направленого створення штамів мікроорганізмів із заданими властивостями.

​

5. Низька вартість мікробіологічного виробництва (вихідним матеріалом мікробного синтезу може бути дешева та доступна сировина).

​

30

Продукти промислової біотехнології

31

Продукти і продуценти, що їх утворюють

​

32

33

Основні етапи технології пошуку та створення мікроорганізмів-продуцентів антимікробних сполук

• Вивчення структури мікробіому в досліджуваному середовищі шляхом метагеномного аналізу
• Виділення чистих культур мікроорганізмів
• Визначення антагоністичної активності до спектру тест-штамів мікроорганізмів та відбір активних перспективних штамів
• Ідентифікація відібраних штамів за послідовністю нуклеотидів 16S рРНК та класичними методами
• Екстрагування метаболітів із культуральної рідини чи біомаси
• Проведення метаболомного аналізу продуктів метаболізму методом хроматографії для визначення спектру метаболітів
• Ідентифікація продуктів метаболізму шляхом повторної хроматографії
• Виділення і очистка методами хроматографії виявленої сполуки
• Конструювання штама-продуцента методами генетичної інженерії
• Дослідження механізмів біологічної дії антимікробної сполуки
• Вивчення молекулярної структури активної молекули
• Доклінічні дослідження
• Клінічні дослідження

​

​

​

34

Визначення антагоністичної активності при пошуку продуцентів

Метаболіти штаму Bacillus amyloliquefaciens 4

35

Нуклеїнові кислоти вилучають з зібраних фільтруванням мікроорганізмів з допомогою Power Water DNA isolation kit (MO BioLaboratories). ДНК екстрагують згідно інструкції (MO BioLaboratories).

Секвенування послідовностей нуклеотидів проводять на платформі Illumina MiSeq.

Біоінформатичний аналіз вихідних послідовностей здійснюють з допомогою програм QIIME та SILVAngs.

36

2.04.2018

Органічні екстракти культуральної рідини досліджуваних штамів бактерій аналізувались методом HRMS для визначення спектру та ідентифікації метаболітів

37

38

Отримані фракції тестували на антимікробну активність

Активні фракції знову аналізувались методом HRMS

39

Створення штамів продуцентів

​

Методи мутагенезу включають одержання та виділення мутантів і використання різних способів обміну спадковою інформацією живих мікробних клітин (метод гібридизації)

Метод злиття протопластів

Генетичне конструювання in vitro, яке базується на використанні генної інженерії, що передбачає маніпуляції з ДНК організмів.

Спрямована еволюція - мішенню мутагенів є лише певні гени

Синтетична біологія – розробка нових біологічних систем

40

41

Клонування рекомбінантної ДНКгенетичне конструювання

• Нобелівську премію з хімії у 2020 році присуджено француженці Еммануель Шарпантьє й американці Дженніфер Дудніза за метод генної інженерії - технологію редагування генома CRISPR-Cas9. З її допомогою дослідники з украй високою точністю можуть змінювати ДНК тварин, рослин і мікроорганізмів.
• Методи дослідження, що базуються на системі CRISPR/Cas9 базується на елементі захисної системи бактерій, який біологи пристосували для внесення змін в ДНК рослин, тварин і людей.
• CRISPR — короткі паліндромні повтори, регулярно розташовані групами (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) – частина імунної системи бактерій. Бактерії постійно повинні відбивати атаки вірусів. Для цього вони виробляють спеціальні ферменти. Кожен раз, коли бактерія убиває вірус, вона розрізає його генетичний матеріал, зберігає його усередині послідовностей CRISPR і використовує за нової атаки віруса. При цьому бактерія виробляє білки Cas9, що несуть фрагмент генетичного матеріалу віруса, якщо вони співпадають з ДНК вируса, Cas9 розрізає чужий генетичний матеріал.  
• В 2013 році було доказано, що CRISPR/Cas9 можно використати для редагування ДНК в культурі клітин мишей і людини. Зясувалось, що технологія дозволяє видаляти непотрібні гени, а й вставляти на їх місце інші.

​

42

Mycoplasma genitalium

43

​

Синтетична біологія — наука, метою якої є створення та вивчення біологічних систем, що не існували раніше

Крейг Вентер

Мікробіологічне виробництво

Це багатостадійний процес, який включає підготовку живильного середовища та посівного матеріалу, засів основних апаратів і ферментацію, сепарування клітин продуцента від культуральної рідини, вилучення цільового продукту.

44

Ферментер

45

Комерційні препарати мікробних ферментів

46

Продуцент ліпаз и протеїназ плісеневий гриб роду Mucor

47

Продуцент целлюлаз Trichothecium roseum (Trichoderma roseum)

48

Bacillus licheniformis - продуцент амілаз

49

Роль мікроорганізмів в очищенні стічних вод Біотехнології очистки стічних вод �

Активний мул

Аеротенк

Мікроорганізми активного мулу

51

БІОПЛІВКА

Анаеробна очистка� Метантенк

52

МІКРОБНІ ТЕХНОЛОГІЇ ОЗДОРОВЛЕННЯ ДОВКІЛЛЯ �ВІД ВУГЛЕВОДНІВ НАФТИ

• Мікробна технологія глибокого очищення стічних вод від вуглеводнів нафти.
• Технологія біоремедіації забруднених нафтою ґрунтів.
• Проведено випробування біотехнології очищення ґрунтів острова Зміїний, стічних вод на Одеському нафтопереробному заводі, поверхні води в морському порту.

​

​

53

​

​

БІОТЕХНОЛОГІЇ АНТИМІКРОБНИХ ТА РІСТСТИМУЛЮВАЛЬНИХ ПРЕПАРАТІВ ДЛЯ РОСЛИН

54

55

��

БІОТЕХНОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ВИЛУГОВУВАННЯ

РІДКІСНИХ І КОЛЬОРОВИХ МЕТАЛІВ З ПРОМИСЛОВИХ ВІДХОДІВ

​

На основі штамів морських бактерій роду Thiobacillus розроблено біотехнологічний метод вилучення рідкісних і дорогоцінних металів галію, германію, цирконію з техногенних відходів від збагачення та спалювання енергетичного вугілля і металургії. Виробничі експериментальні випробування на Ладижинській ТЕС, підприємствах ВАТ “Львівська вугільна компанія” та ЗАТ “Донмет”. Встановлено здатність ізольованих штамів тіонових бактерій зменшувати вміст сірки в вугіллі до 50%, що лягло в основу мікробіологічного методу знесірчення енергетичного вугілля.

56

�Мікроорганізми як фактор біологічних пошкоджень промислових споруд, конструкцій, пам’ятників архітектури, мистецтва

57

58

​

На завершення звертаю вашу увагу на Загальні концепції курсу Мікробіологія. Вони включають базові ключові твердження, які вважаються такими, що мають базове довготривале значення в Біології:

• Клітини, органели та всі основні метаболічні шляхи еволюціонували з ранніх прокаріотичних клітин.

​

• Мутації та горизонтальний перенос генів в процесі еволюції сформували величезну різноманітність мікроорганізмів.

​

• Традиційне визначення виду не завжди можна застосувати до мікробів через нестатеве розмноження та часте горизонтальне перенесення генів.

​

• Еволюційна спорідненість організмів найкраще визначається порівнянням нуклеотидних послідовностей та побудовою філогенетичного дерева.

​

• Клітини еукаріотичних мікроорганізмів на відміну від прокаріотичних містять спеціалізовані мембранні структури. Бактерії та археї мають спеціалізовані структури, які часто надають їм унікальні можливості. Бактерії мають унікальні клітинні структури, які можуть бути мішенями для антибіотиків, імунної системи та фагової інфекції.

59

• Бактерії та археї використовують різні типи метаболізму, їх комбінації та демонструють велике і часто унікальне метаболічне різноманіття, наприклад, фіксація азоту, виробництво метану, аноксигенний фотосинтез.

​

• Виживання та ріст будь-якого мікроорганізму в певному середовищі залежить від його метаболічних характеристик. Ріст мікроорганізмів можна контролювати фізичними, хімічними, механічними чи біологічними засобами.

​

• Хоча центральна догма є універсальною для всіх клітин, процеси реплікації, транскрипції та трансляції відрізняються у бактерій, архей та еукаріот.

​

• Механізми регуляції експресії генів та механізми зміни активності ферментів забезпечують адаптацію мікроорганізмів до змін умов середовища. Клітинними геномами можна управляти, щоб змінити функцію клітин.

​

​

60

• Мікроорганізми всюдисущі та забезпечують функціонування різноманітних та динамічних екосистем і біосфери в цілому (біогеохімічні цикли).

​

• Більшість їх у природі живуть у спільнотах біоплівок. Мікроорганізми та їх середовище взаємодіють і змінюють один одного.

​

• Мікроорганізми можуть взаємодіяти з біологічними (людина, тварини, рослини) та небіологічними об’єктами у корисний, нейтральний або шкідливий спосіб та змінюють один одного.

​

• Мікроорганізми є основними моделями, які дають нам фундаментальні знання про життєві процеси та об’єктами, що використовуються в біотехнології для виробництва різноманітних практично корисних для людини продуктів.

​

• Оскільки справжнє різноманіття мікробного життя в основному невідоме, його наслідки та потенційні переваги ще чекають на подальше вивчення.

​

БАЖАЮ УСПІХІВ!

� Усім лекціям кінець, �хто сприйняв їх – молодець!�

61