1 of 41

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПО СЭНГЕРУ

Анастасия Жарикова, Екатерина Рюмина

ФББ МГУ 2024

2 of 41

Секвенирование

Определение последовательности некоторого нерегулярного биологического гетерополимера – белка или нуклеиновой кислоты

3 of 41

Экскурс в историю

Секвенирование по Сэнгеру (1975 – 1977)

Фредерик Сэнгер, Нобелевская премия 1980 (вторая!) (с Уолтером Гильбертом и Полем Бергом)

Полимеразная цепная реакция (1985 – 1986)

Кэрри Муллис, Нобелевская премия 1993 (совместно с Майклом Смитом)

NGS — совокупность методов (454, Illumina, Oxford Nanopore, PacBio и проч.) (2005 – наст. вр.)

4 of 41

Полимеразная цепная реакция - ПЦР

https://www.youtube.com/watch?v=DkT6XHWne6E
https://www.dnalc.org/view/15475-The-cycles-of-the-polymerase-chain-reaction-PCR-3D-animation.html
https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo
Для чего нужна?
Что на вход?
Времена этапов процесса

5 of 41

ПЦР

https://biomolecula.ru/articles/metody-v-kartinkakh-polimeraznaia-tsepnaia-reaktsiia

8 of 41

Реакция полимеризации

9 of 41

Секвенирование ДНК

Выделение ДНК

10 of 41

Секвенирование ДНК

Метод «терминаторов»

11 of 41

Секвенсовая реакция

12 of 41

Схема процесса секвенирования по Сэнгеру

https://www.youtube.com/watch?v=FvHRio1yyhQ

13 of 41

Ниже даны результаты секвенирования по Сэнгеру четырёх пациентов. У кого их них мутация?

14 of 41

Современная методика

Сейчас вместо того, чтобы проводить форез в четырёх пробирках с разными ddNTP, проводят один форез на смеси, которая содержала все четыре типа ddNTP, каждый из которых окрашен по-своему

Форез проводится в капиллярах (а не в геле) — так у него получается больше разрешение

Максимальная длина прочтения — не больше 1000-1200 нуклеотидов

Почему до сих пор применяется, если есть более производительные методы секвенирования?

15 of 41

Современный капиллярный секвенатор

Много капилляров – секвенируем параллельно несколько фрагментов ДНК

16 of 41

ddNTP с красителями

Для секвенирования к терминирующему нуклеозиду в зависимости

от их типа – A, T, G, C – присоединяют флюорофоры, излучающие в разных длинах волн

17 of 41

Схема эксперимента

Полоски могут быть размазанными и наезжать друг на друга.

Помните: различие между полосками определяется

Единственным нуклеотидом!

18 of 41

Хроматограмма

19 of 41

Итого

Сначала мы готовим препарат:

нам необходима чистая фракция ДНК, которую надо отсеквенировать;

она амплифицирована с помощью ПЦР,

а также на неё имеются специфические праймеры

Раствор для секвенирования:

・ матрица ДНК в большом количестве;

・ нуклеотиды (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) — много;

・ терминирующие нуклеотиды (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) — мало;

・ один праймер;

・ ДНК-полимераза

20 of 41

Расшифровка хроматограммы

Полученную хроматограмму надо верно проанализировать, чтобы восстановить, какая последовательность ДНК у нас была в образце

Чаще всего программное оборудование секвенатора делает это само.

Этот процесс называется base calling

Во время base calling’а могут происходить ошибки

21 of 41

Результат автоматического секвенирования по Сэнгеру

22 of 41

Идеальная хроматограмма

Сила сигнала – это интенсивность детектируемого света в данный момент времени
На графике отражена высотой

24 of 41

Шум

В разы ниже сигнала (в идеале)
Это световой сигнал от посторонних молекул ДНК, загрязнения.

Например, праймеры при ПЦР отжигались и на посторонний фрагмент ДНК.
Или малая доля праймеров в основной реакции отожглась на другое место в целевой ДНК.

25 of 41

Качество сигнала

Качество аннотации каждой буквы отображается в программах для визуализации

Подробности тут: Phred quality score - Wikipedia

26 of 41

Источники полиморфизмов

Гетерозиготы
Соматические мутации
Несколько разных образцов ДНК
Несколько генов в разных локусах
Ошибки во время ПЦР

27 of 41

Полиморфизм в гене родопсина

28 of 41

Еще полиморфизмы

29 of 41

Полиморфизм, шум или одна буква?

30 of 41

A, T, G, C, … ???!!!

https://www.hgmd.cf.ac.uk/docs/nuc_lett.html

31 of 41

Две разных ДНК в препарате

32 of 41

Появление вторых пиков

В результате делеций на хроматограмме в неожиданный момент начнут систематически возникать вторые пики

33 of 41

Разное расстояние между сигналами

34 of 41

Пятно краски

Может возникнуть из-за ошибок во время фореза

35 of 41

Проскальзывание полимеразы

36 of 41

Проблемы в начале

Короткие неспецифические участки, на которые могут отжигаться праймеры + короткие фрагменты могли не переосадиться после секвенсовой реакции

37 of 41

Проблемы в конце

Фрагменты длиной 1000 и 1001 нуклеотидов на форезе различаются хуже, чем фрагменты длиной 51 и 51 нуклеотид