NMR metoda pro analýzu včelího metabolismu a včelích produktů

Doc. Ing. Jaroslav Havlík, Ph.D.

​

havlik@af.czu.cz

1. Seznámení se s NMR
2. Analýza zimních a letních včel
3. Analýza metabolismu včel v průběhu roku
4. Analýza včelích produktů

NMR = nukleární magnetická rezonance

4

Courtesy: Agilent

Steady state

Excitation after RF pulse

Relaxation

5

Courtesy: Agilent

Steady state

Excitation after RF pulse

Relaxation

1. NMR analýza pro pochopení vztahů mezi zimními a letními včelami

Letní včely žijí 15 až 38 dní a jsou v úlu od března do pozdního srpna

Zimní včely žijí 140 až 320 dní a jsou v úlu od srpna do jara

• Rozdíly v dlouhověkosti jsou dány aktivací řady biochemických drah
• Dlouhověkost je provázena vysokými zásobami vitelogeninu v tukovém tělese a hlavě a nízkou hladinou juvenilního hormonu

Winter bees diminish & population of summer bees grow

Actively collecting food,

Colony growth

Brood rearing

begins

Overwintering

Summer bees & winter bees

Co-existing

Winter bees begin to emerge

Fluri et al., 1982; Mattila et al., 2001; Doke et al., 2015

Vitellogenin, Juvenile hormone

Immunity

Stress resistance

Antioxidant function

Nutrient status

V NMR spektrech metanolových extraktů včelích těl bylo identifikováno celkem 36 metabolitů: Bylo nalezeno 13 aminokyselin, 4 karboxylové kyseliny, 5 aminů, 3 sloučeniny obsahující cholin, 3 nukleosidy, 2 nukleotidy, 2 monosacharidy, 2 disacharidy, 1 nukleobáze a S-methyl-L-cysteinsulfoxide (SMCSO)

• NMR 500 MHz, potlačení signálu vody

PCA

Zasazení metabolitů do známých metabolických drah dlouhověkosti

2. NMR analýza pro pochopení vztahů mezi zimními a letními včelami

Cílem této studie bylo

• sledovat změny metabolitů v těle včely medonosné v průběhu jednoho roku.
• prozkoumat metabolické otisky včel podle ročních období

1.AMP, 2.NAD⁺, 3.Inosine, 4.Adenine, 5.Histidine, 6.Uridine, 7.Phenylalanine, 8.Sucrose, 9.Glucose, 10.Trehalose, 11.sn-glycero-3-phosphocholine, 12.Fructose, 13.Proline, 14.O-phosphocholine, 15.unknown, 16.unknown, 17.Choline, 18.β-alanine, 19.Dimethylsulfone, 20.Malonate, 21.Putrescine, 22.Creatine, 23.Lysine, 24.Asparagine, 25. unknown, 26.unknown, 27.Glutamine, 28.Succinate, 29.Suberate, 30.Acetate, 31.Alanine, 32.Threonine, 33.Valine, 34.Isoleucine, 35.Leucine, 36.Glycine

Apis mellifera

Co se děje ve včelím těle

A NMR spectrum of honey bee’s body

By Metaboanalyst.ca

Log transformation, Auto scaling

Distance measure: Euclidean

Clustering algorithm: Ward

Group averages

Metabolite↓

Month

Nov

Dec

Jan

Feb

May

Jun

Jul

Apr

Oct

Mar

Aug

Sep

January

February

March

April

May

June

July

August

September

October

November

December

Beta-alanine

Hierarchická klastrová analýza

Transition1

N=18

Summer

N=12

Transition2

N=18

Winter

N=18

Unit: mg/honey bee, ± SE

Sacharidy

Dynamika metabolitů v průběhu roku

Transition1

N=18

Summer

N=12

Transition2

N=18

Winter

N=18

Transition1

N=18

Summer

N=12

Transition2

N=18

Winter

N=18

Unit: mg/honey bee, ± SE

Esenciální aminokyseliny

Ostatní

Transition1

N=18

Summer

N=12

Transition2

N=18

Winter

N=18

Unit: mg/honey bee, ± SE

Honey bee vitellogenin model

Harwood et al 2017

GPC: sn-glycero-3-phosphocholine

Cho: Choline, PCho: O-phosphocholine

PC: Phsphatidylcholine

Phosphatidylcholine biosynthesis

Iorio et al 2005

Cholin

Transition1

N=18

Summer

N=12

Transition2

N=18

Winter

N=18

Unit: mg/honey bee, ± SE

Transition1

N=18

Summer

N=12

Transition2

N=18

Winter

N=18

Nukleosidy a nukleotidy

S-methyl L-cystein sulfoxide (SMCSO)

3. NMR metoda pro určení botanického původu medu

• Analyzováno celkem 30 řepkových, 30 akátových a 30 medovicových medů s pomocí NMR

?

Botanický původ – PCA, OPLS-DA

PCA – řepka, akát,

PC1 18,5 % variace

PCA – řepka, akát, medovice,

PC1 26,6 % variace

OPLS-DA řepka, akát,

Q² = 0,59 a R² = 0,75

Rozdíly řepkový a akátový med

Komponentní zátěže (loadings) řepkového a akátového medu z OPLS-DA analýzy promítnuté do auto-normalizovaného NMR spektra, *nejistá identifikace

• NMR umožňuje zařadit neznámý vzorek a určit který zdroj nektaru dominuje

• vyšší obsah valinu, leucinu a isoleucinu
• více derivátů kyseliny benzoové, niacin, trigonellin, S-methyl cystein sulfoxid (SMCSO)
• vyšší obsah glukosy

• vyšší obsah fruktosy, turanosy, sacharosy a maltosy
• pinocembrin, kyselina abscisová

Akátový med

Řepkový med

• Nukleární magnetická rezonance poskytuje neobvyklý celostní vhled do včelího metabolismu
• Ve snůškovém období včely obsahují v těle vysoké množství záhadné chemikálie SMCSO
• Dlouhověkost je spojena s úsporným metabolismem
• NMR je metoda, která dokáže botanicky klasifikovat neznámý med

Závěr

Okamžik zrození včely