Diversidad de productos naturales, su biosíntesis y manipulación
Dra Lorena Fernández Martínez
fernandl@edgehill.ac.uk @lore_fermar
Edge Hill University (Ormskirk, UK)
Para poder entender la biosíntesis de productos naturales…
…necesitamos entender las rutas metabólicas
Metabolismo primario y especializado
¿Qué entendemos por metabolismo?
El metabolismo es un término colectivo para todas las reacciones químicas que tienen lugar en los sistemas vivos.
El metabolismo primario se refiere a la química que es común a la mayoría de las especies y es responsable de sintetizar los componentes básicos de la vida llamados metabolitos primarios (por ejemplo, aminoácidos, carbohidratos, ácidos grasos, nucleótidos y sus precursores). Los metabolitos primarios están directamente involucrados en el crecimiento, desarrollo y reproducción normales de un organismo y se producen utilizando la misma vía (o muy parecida) en todas estas especies.
Metabolismo primario y especializado
El metabolismo especializado se refiere a la química que a menudo es única a una especie en particular (o de ocurrencia general limitada) y que no es esencial para la supervivencia del organismo en cuestión. Los productos del metabolismo especializado se denominan metabolitos especializados (o productos naturales). A menudo, estos productos se utilizan en la defensa contra depredadores (p. ej., antibióticos), parásitos y enfermedades, para la competición entre especies, la comunicación entre células (quórum sensing en bacterias) y para facilitar los procesos reproductivos (agentes colorantes, olores atractivos, p. ej., en plantas ).
El metabolismo primario y especializado están estrechamente relacionados
*Schniete JK et al., 2018. mBio 9:e02283-17
¡Los productos naturales vienen en muchas formas y tamaños!
¿Por qué es importante la diversidad de productos naturales?
Natural products are normally assembled in three phases
Fase I: ensamblaje de bloques de construcción (precursores) Acil-CoAs, aminoácidos, nucleótidos … Tened en cuenta que algunos precursores se utilizan directamente del metabolismo primario mientras que otros son específicos del metabolismo especializado y aparecen agrupados en los clusters
Fase II: síntesis de la molécula central
Cadena de ensamblaje
Fase III: reacciones de modificación posteriores al ensamblaje Química redox, metilación, glicosilación, halogenación…
Enzima 1
Enzima 2
Enzima 3
Producto Natural
Familias de productos naturales más comunes y sus enzimas biosintéticas
Polycétidos – macrólidos, polienos, aromáticos…
Policétido sintasas (PKS): tipos I, II, III, híbridos
Péptidos –depsipéptidos, betalactámicos, lantipéptidos, tiopéptidos… Péptidos sintetizados ribosomalmente y modificados postraduccionalmente (RIPPs)
Péptido sintetasas no ribosomales (NRPS) – tipo I, II, híbridos
Terpenoides: mono-, sesqui-, di-, tri-, meroterpenoides…
Alcaloides: indol, tropano, pirrol, nicotínico, piridina…
Carbohidratos: desoxiazúcares, iminoazúcares, aminoglucósidos…
Nucleósidos
Mezclas de estas clases
¡Entender la biosíntesis de productos naturales nos permite manipularlos!
Polycétidos
Polímeros de "acetato" en forma de malonil CoA (y derivados, e.g, metilmalonil CoA)
Enzimología similar a la síntesis de ácidos grasos con módulos enzimáticos que llevan a cabo reacciones de condensación, cetorreducción, eliminación y reducción, pero con mayor diversidad en la presencia/ausencia de módulos y, por lo tanto, mayor diversidad en el estado de oxidación del carbono.
Tres tipos:
Tipo I enzimas grandes de múltiples subunidades con módulos colineales pueden dar lugar a grandes macrociclos
Tipo II varias enzimas independientes, a menudo generan productos aromáticos
Tipo III enzimas independientes más pequeñas, productos aromáticos, sin ACP
¡La modularidad es una oportunidad fantástica para diseñar nuevas moléculas!
1. Colección de “scaffolds”
2. Colección de genes accesorios adicionales
3. Ensamblaje en circuito biosintético en huésped adecuado y/o in vitro
¡La modularidad es una oportunidad fantástica para diseñar nuevas moléculas!
Modify precursor
X
Eliminar módulos enzimáticos
X
Modificar el precursor
Enzimas de otra ruta
Pre-PKS
Enzima(s)
Paso 1
Ensamblar el precursor
Paso 2
Cargar precursor
Paso 3
Añadir unidades para crear la cadena del policétido
Paso 4
Escisión y ciclación
Policétido Sintasa (PKS)
Paso 5
Modificaciones estructurales adicionales
Post-PKS Enzima(s)
Módulo enzimático
Precursor
Unidades de extensión
Alternativas post-PKS
Ejemplos de estrategias para modificar rutas biosintéticas
Ruta biosintética “normal”
Enzima 1
Enzima 2
Precursores
Proporcionar nuevos precursores
Precursores
Enzima 1
Enzima 2
Mutasíntesis
Precursores
Enzima 1
Enzima 2
X
Precursores
Enzima 1
Enzima 2
X
Biosíntesis combinatoria
Precursores
Enzima 1
Enzima X (otra ruta)
Métodos para estudiar la síntesis de productos naturales
Haz una suposición informada (¡o pídele a un bioquímico que proponga una!)
Estudia la estructura, trata de averiguar el origen biosintético en función de rutas ya conocidas o la coexistencia de estructuras relacionadas para identificar el grupo de genes biosintéticos.
Generación de mutantes “de bloqueo” y análisis químico
Enzima 1
Enzima 2
Enzima 3
Producto Natural
No observado normalmente
Generación de mutantes “de bloqueo” y análisis químico
Enzima 1
Enzima 2
Enzima 3
Producto Natural
Inactivación
X
Intermediario o producto derivado observado
Estudio de enzimas biosintéticas
Estrategias experimentales:
Vamos a estudiar una clase de productos naturales diferente...
Péptidos
Ribosomales
Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide (RiPPs)
Codificado por ARNm, limitado a 20 aminoácidos especificados por ARNt
Normalmente codificados como propéptidos
Normalmente modificados postraduccionalmente, e.g. lantibióticos
Generalmente linealesn (aunque puede ser reticulados y circularizados)
No ribosomales
Sintetizado por grandes complejos enzimáticos, sin ARNm, por lo tanto, no limitado a 20 aminoácidos proteicos
Muchas modificaciones postraduccionales (diversidad química)
Productos pueden ser lineales y/o cíclicos
Péptidos sintetizados ribosomalmente y modificados postraduccionalmente
X
O
X
Modificaciones postraduccionales, incluyendo ciclaciones internas
X
X
3
+H N
X
O
X
2
CO -
X
NH
O
X
X
O
Péptido líder
Péptido posterior
12 +1 +2
Péptido precursor
Péptido Central
-2 -1 1
Hidrólisis del péptido líder/seguidor
Macrociclación del péptido central
Como todas las clases de productos naturales, los RiPP son muy diversos
Los RiPPs existen desde hace mucho tiempo...
Un poco de historia de los RiPPs
J. Bacteriol. 1928, 16, 321.
Nisina
Un año antes del primer artículo de Fleming sobre la actividad inhibitoria de Penicillium
1933: Aislamiento de una substancia resistente al calor
1947: Purificación de cristales
1953: Producción comercial
1971: Estructura
1993: Cluster de genes
Un poco de historia de los RiPPs
S
S
S
S
S
Nisina
Ala
Ala
Leu Ala
Leu
Dha
Val
His
Lys
Ala
Ser
Ile
Asn Met
Ala
Dha
Lys
Gly
His
Abu
Gly
Abu
Dhb Ala
Met
Ile
Ala
Ile
Abu
Ala Lys
Abu
Pro Gly
+H3N
-O
Péptido líder
Péptido central
MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSK
O
Estructura y biosíntesis de las principales clases de RiPPs
Principales familias de RiPPs
Skinnider, M. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2016, 113, E6343.
Productos naturales únicos por familia RiPP
Clusters de genes biosintéticos por familia RiPP y clase taxonómica
Péptidos de lazo
Microcina J25
N H
OH
Pro
Gly
Thr
Ile
Val
Gly
Phe
Pro
His
Val
Gly
Gly
Ala
Tyr
O
Glu
Phe
Tyr
Gly
Ile
Gly Ser
Estructura de RMN
Atributos generales en toda la familia
Tietz et al. Nat. Chem. Biol. 2017, 13, 470.
Lantipéptidos
S
S
S
S
S
Nisina
Ala
Ala
Leu Ala
Leu
Dha
Val
His
Lys
Ala
Ser
Ile
Asn Met
Ala
Dha
Lys
Gly
His
Abu
Gly
Abu
Dhb Ala
Met
Ile
Ala
Ile
Abu
Ala Lys
Abu
Pro Gly
+H3N
O
-O
Tiopéptidos
N H
N
N
H N
O
S
N
HN
O
O
N
NH
O
NH
HO
O
S
N
O
HO
S
NH
N
S
S
OH
HO
N H
O
N H
N
N
H N
O
S
N
S O
O
NH
O
S
N
N H
OH
O
N
S
HN
O
HN
HO
O
N
S
O
H N
N H
H N
O
O
NH
O H
N
OH
OH
NH2
O
OH
Tiostreptona
Streptomyces laurentii
Tiocilina
Bacillus cereus ATCC 14579
Ejemplo de ruta biosintética de RiPPs: microbisporicina
Lantibiótico de Clase I
Modificado postraduccionalmente - puentes de lantionina + modificaciones inusuales
Inhibe la biosíntesis de la pared celular al unirse al lípido II
Activo contra la mayoría de bacterias Gram-positivas incluyendo MRSA, VRE y Clostridium difficile
P
r
o
G
l
y
1
Abu
Ala
Val
Dhb
Phe
Ala
Ala
Dha
Leu
Ala
Pro
G
l
y
Ala
A
s
n
Ala
Ala
Ala
23
S
S
S
NH
S
Thr
G
l
y
G
l
y
Trp
Cl
OH
OH
S
CH
CH
=
Castiglione, F. et al. (2008)
El grupo de genes biosintéticos de microbisporicina
B
T
C
F
E
D
U
V
H
S
N
A
W
X
J
Y
Z
O
Q
R
21.5kb
Lantibiotic biosynthesis; aminovinyl-cysteine formation
Putative Na+/H+ antiporter; unknown function
Hypothetical lipobox-containing protein
Putative lantibiotic export proteins; ABC transporter
Regulatory protein
Conserved gene of unknown function
ECF sigma factor and anti-sigma factor
Hypothetical membrane protein
Lantibiotic pre-peptide
Putative immunity proteins; ABC transporter
ATP-binding protein and ABC permease
Lantibiotic biosynthesis; dehydratase and cyclase activities
Tryptophan chlorination; tryptophan halogenase and flavin reductase
Cytochrome p450
A
N
T
A
A
F
G
P
S
CH
CH
NH
S
G
G
A
A
S
V
W
A
Db
Da
L
Ab
A
P
G
S
S
A
Cl
HO
HO
X
X
¿Un nuevo mecanismo de regulación en el cluster de microbisporicina?
MlbR codifica una proteína hipotética
No había hits significativos de BlastP en la base de datos
Predicción de un dominio de unión al ADN de hélice-giro-hélice C-terminal
Foulston and Bibb (2010) Proc Natl Acad Sci 107(30):13461-6
WT
MlbR++
Fernández-Martínez et al., (2015) Mol Microbiol.97(3):502-14
¿Un nuevo mecanismo de regulación en el cluster de microbisporicina?
MlbX es un homólogo de las proteínas del factor sigma de función extracitoplasmática (ECF) y MlbW es su factor anti-sigma
MlbW contiene seis hélices transmembrana y una cola citoplásmica N-terminal (predicción bioinformática)
MlbW funciona como un factor anti-sigma, secuestrando MlbX en la membrana
Interacción de MlbX/MlbW demostrada en E. coli
MlbX
MlbW
Foulston and Bibb (2010) Proc Natl Acad Sci 107(30):13461-6
WT
X
MlbR++
WT
MlbX++
Fernández-Martínez et al., (2015) Mol Microbiol.97(3):502-14
Localización del inicio de la transcripción
Predicción bioinformática de seis operones dentro del cluster confirmada por mapeo S1
Secuencias consenso específicas de ECF identificados delante de cinco de ellos
Presunto sitio de union de MlbX
-35
-10
N15
Región promotora de mlbA
-10
-35
N17
B
T
C
F
E
D
U
V
H
S
N
A
W
X
J
Y
Z
O
Q
R
How is the transcription of the structural operon activated?
There is a second promoter upstream of mlbR
Determined by RT-PCR and 5’ extension RACE experiments
B
T
C
F
E
D
U
V
H
S
N
A
W
X
J
Y
Z
O
Q
R
Modelo actual para la ruta de biosíntesis de microbisporicina
B
T
C
F
E
D
U
V
H
S
N
A
W
X
J
Y
Z
O
Q
R
ppGpp
X
W
R
U
U
T
T
Estrés nutricional
Modelo actual para la ruta de biosíntesis de microbisporicina
B
T
C
F
E
D
U
V
H
S
N
A
W
X
J
Y
Z
O
Q
R
X
W
R
Altos niveles de producción
Regulación por retroalimentación
U
U
T
T
¿Cuánta diversidad química nos queda por descubrir?
“como sabemos, hay conocidos conocidos; hay cosas que sabemos que sabemos. También sabemos que hay incógnitas conocidas; es decir, sabemos que hay algunas cosas que no sabemos. Pero también hay incógnitas desconocidas, las que no sabemos que no sabemos”
Para acabar…
¡Muchas gracias por vuestra atención!
¿Preguntas?
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