FECCIF24 – III Feira Estadual de Ciência e Cultura do IFSP – de 21 a 26 de Outubro de 2024
A era atual é marcada por um alto surgimento de bactérias e fungos resistentes a todas as classes de antimicrobianos já descobertos, portanto, é essencial que se descubra novos antibióticos e antifúngicos que combatam esses micróbios. Por isso, foi feita uma bioprospecção em 2023 para isolar bactérias do mel que possuem a capacidade de secretar antibióticos e antifúngicos. Nesse projeto, diferentes méis foram selecionados para plaqueamento em placas de petri. Os microrganismos que cresceram foram isolados e cultivados para genotipagem. Estes também foram utilizados em ensaios de halo de inibição para descobrir quais possuem capacidade de secreção de antimicrobianos. No presente trabalho, é proposto o sequenciamento de uma linhagem de bactéria isolada e a montagem do genoma para a identificação dos genes responsáveis pela produção de antimicrobianos. Primeiramente será testada a eficácia dos microrganismos contra fungos e bactérias causadores de doenças em plantas. Para as linhagens que apresentaram maior eficácia na produção de antimicrobianos, será realizada sequenciamento utilizando a tecnologia Nanoporo, MinION, que identifica as bases de DNA, fornecendo então os dados brutos. Para a montagem do genoma e sua anotação será desenvolvido um programa baseado principalmente, em Python. Ademais, utilizará a plataforma antiSMASH para buscar grupos de genes responsáveis pela produção de antimicrobianos. Desta maneira, serão sugeridos quais genes podem ser responsáveis pela produção antimicrobiana, para futuramente possibilitar o aumento da capacidade produtiva das bactérias cultivadas.
INTRODUÇÃO
OBJETIVOS
METODOLOGIA
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CARACTERIZAÇÃO DE NOVAS LINHAGENS DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE ANTIBIÓTICOS E ANTIFÚNGICOS
Katherine B. Marchesan¹, Luiza R. de Souza²,
Márcio A. Miranda3, Elizabeth Bilsland4
1Instituto Federal de São Paulo, Campinas, Brasil - katherine.b@aluno.ifsp.edu.br
2Instituto Federal de São Paulo, Campinas, Brasil - luiza.souza@aluno.ifsp.edu.br
3Instituto Federal de São Paulo, Campinas, Brasil - m_amiranda@ifsp.edu.br
4Instituto de Biologia, Unicamp, Brasil - bilsland@unicamp.br
O impacto deletério das doenças infecciosas à saúde global é cada vez mais marcante devido a um aumento na incidência de resistência bacteriana e a redução dramática na descoberta de novos antimicrobianos. Ademais, diversos fungos de importância agrícola desenvolveram resistência contra os fungicidas do mercado e passaram destruir ainda mais as lavouras.
Com isso, busca-se caracterizar antimicrobianos que foram isolados durante um projeto realizado em 2023. O projeto consistiu em cultivar e isolar microrganismos originários do mel, e a partir de ensaios de halo de inibição, selecionar os micróbios capazes de secretar antifúngicos e antibióticos.
O presente projeto visa dar continuidade à validação fenotípica de organismos isolados do mel, além de realizar o sequenciamento dos micróbios e a identificação dos genes responsáveis pela síntese de antimicrobianos a partir do desenvolvimento de pipeline computacional. Com o intuito de desenvolver antimicrobianos novos com maior capacidade de secreção aos produtos disponíveis no mercado
Para analisar a produção antibacteriana e antifúngica dos microrganismos, eles foram testados em ensaios de halo de inibição contra a bactéria Xanthomonas citri, causadora do cancro cítrico, e fungos fitopatogênicos, como Rhizoctonia sp. e Sclerotinia sp.
Para os ensaios de antibacterianos, diluições de X. citri foram preparadas e plaqueadas na superfície de placas Luria-Bertani (LB) com ágar. Pipetou-se os microrganismos do mel diluídos 1:100 sobre discos de 3 mm de papel de filtro estéril, posicionados ao redor da placa. Após incubação, fotografou-se as placas e mediu-se os halos de inibição para avaliar a secreção de compostos antibacterianos.
Para os halos de inibição antifúngico, preparou-se placas de meio Ágar Batata Dextrose (BDA) e distribuiu-se sob elas, papéis de filtro estéreis nos quais foram pipetados microrganismos do mel diluídos 1:100. No centro de cada placa, foram posicionados discos contendo hifas de fungos patogênicos. As placas foram incubados e fotografadas para monitoramento dos halos de inibição.
Para a extração de DNA genômico de bactéria gram negativa, o preparo de biblioteca de DNA para sequenciamento por Nanoporo e o preparo e carregamento a flow cell para sequenciamento por Nanoporo, foram utilizados, respectivamente: O kit Wizard® Genomic DNA Purification Kit da Promega (A1125), o Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109) e o protocolo Flow Cell Priming Kit (EXP-FLP002) da Oxford Nanopore Technologies. Após o carregamento do DNA, foram seguidas as instruções no software para proceder com o sequenciamento.
Para a detecção de variantes, alinhamento e a análise dos dados brutos, irá se empregar o uso do software EPI2ME, além da utilização dos guias contidos na plataforma GitHub, que engloba códigos que irão auxiliar na montagem e anotação do novo genoma, para o desenvolvimento do software. Após a montagem, os genomas serão submetidos à plataforma antiSMASH para anotação, identificação e análise eficiente de clusters de genes.
Foram realizados testes de halo de inibição para aprox. 70 isolados contra a bactéria fitopatogênica X. citri e com os fungos fitopatogênicos S. sclerotiorum e R. solanum. Nesses experimentos foi incluída a B. subtilis usado em controle biológico (marcado com adesivo colorido). Observa-se que diversos dos isolados possuem atividade comparável ao padrão comercial (Figura 1).
RESULTADOS E DISCUSSÕES
REFERÊNCIAS
CONCLUSÃO
Com base na caracterização fenotípica, foi selecionada uma linhagem para sequenciamento genômico e posterior identificação de grupos de genes responsáveis pela produção dos antimicrobianos. Para isso teve-se acesso a reagentes para sequenciamento por Nanoporo com data de validade de 2020. Apesar das claras limitações decorrentes do trabalho com reagentes vencidos, a primeira tentativa de sequenciamento gerou 107 510 pares de bases. Apesar de muito aquém das bases necessárias, indica que com novas rodadas de sequenciamento poderá obter um maior volume de resultados para completar o genoma. Com o genoma completo, será possível realizar as análises bioinformáticas para a identificação dos operons responsáveis pela síntese dos antimicrobianos, e progredir no desenvolvimento do programa para facilitar o processo de montagem de genoma a partir dos dados brutos para futuros pesquisadores.
BAYNE, Charlie. Nanopore Pipelines. 2023. Disponível em: https://github.com/baynec2/nanopore_pipelines. Acesso em: 30 mar. 2024
LU, Hengyun; GIORDANO, Francesca; NING, Zemin. Oxford Nanopore MinION Sequencing and Genome Assembly. 2016. Disponível em: https://academic.oup.com/gpb/article/14/5/265/7224938?login=false. Acesso em: 17 fev. 2024.
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Figura 1 - Antibiogramas X. citri, Sclerotinia sclerotiorum e Rhizoctonia solanum
Fonte: elaborado pelo autor (2024)
Foram realizadas diversas tentativas de extração de DNA genômico da linhagem escolhida, atingindo um rendimento de até 58,4 ng/μl. Utilizando o DNA genômico extraído do Bacillus, foi preparada a biblioteca de DNA para sequenciamento por Nanoporo. Infelizmente todos os reagentes utilizados para o preparo da biblioteca ultrapassaram o prazo de validade já em 2020, portanto havia ciência de que a qualidade do preparo seria ruim. Seguindo as recomendações do fabricante foi possível obter DNA com adaptadores na concentração de 2,17 ng/ul.
Espera-se montar um programa simples e eficiente capaz de receber os dados brutos de sequenciamento e montar e anotar o genoma. A partir da anotação realizada pelo antiSMASH, espera-se identificar os genes responsáveis pela produção dos antibióticos e antifúngicos, possibilitando futuramente o aumento da capacidade produtiva de antimicrobianos.
Foi avaliado a qualidade dos poros ativos nos Flowcells. Um flowcell novo tem aproximadamente 800 poros ativos, porém o flowcell vencido que foi utilizado tinha somente 17 poros. Para a familiarização com o equipamento, procedeu-se com o sequenciamento e foi obtido 107 mil pares de bases sequenciadas (Figura 2).
Figura 2 - Sequenciamento por nanoporo
Fonte: elaborado pelo autor (2024)
RESUMO