Intitulé de la matière : Génie fermentaire et bioréacteurs

Crédits : 8

Coefficients : 4

Contenu de la matière :

1. Biomasse de première, deuxième et troisième génération
2. Cinétique microbienne et enzymatique
3. Ingénierie des bioréacteurs du laboratoire
4. Régulation des paramètres de culture
5. Suivi de fermentation
6. Techniques d’extraction des produits de la fermentation
7. Passage d’échelle pilote et industriel d’une fermentation.
8. TP :

 Conduite d'un fermenteur de laboratoire : initiation 1

• Vidéos illustrées “ Renewable Energy 101: Biomass Electricity”
• Principe de fonctionnement
• https://www.youtube.com/watch?v=nVl17JLn_u0
• Pourquoi la biomasse est une source d’énergie renouvelable (sustainable)?
• https://www.youtube.com/watch?v=-jln6yi7LF0
• Procédés de conversion de la biomasse en énergie
• https://www.youtube.com/watch?v=yHWcddUZ35s

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Vidéos d’initiation illustrées

Définition de la biomasse et ses différents types

• Représente environ 80 % des énergies renouvelables dans le monde
• Représente environ 65 % des énergies renouvelables en Europe

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• Actuellement fort développement de l'ensemble des filières biomasse
• Forte volonté politique (débouché pour l'agriculture, utilisation des terres, recherche d'indépendance énergétique)

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Les sources de biomasse :

" englobent toutes les ressources agro-énergétiques dont les produits et sous-produits peuvent être destinées à la production de bioénergie

• Cultures de grains amylacés

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Biomasse 1^ère génération (culture dédiée)

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• la canne à sucre, la betterave, et autres ; - Les graminées : le maïs, le sorgho sucrier et autres ;

• Les plantes amylacées : le manioc, la patate douce, le taro et autres

Les plantes oléagineuses : le palmier à huile, le colza, le soja, l’arachide, et autres

Dégradation de la Biomasse amylacée

• L’amidon constitue la principale réserve glucidique végétale, il renferme deux polysaccharides
• l’amylose (constituant majeur) :
• est une molécule flexible, de structure linéaire correspondant à plusieurs centaines de résidus α D-glucopyranose unis par des liaisons α 1-4
• l’amylopectine (constituant mineur).
• L’amylopectine est aussi un polymère du glucose, composé de chaines linéaires similaires à celle de l’amylose, mais reliées les unes aux autres par des liaisons α (1-6).
• Les points de branchement sont distants d’environ 20 à 30 unités de glucose.

Les amylases microbiennes peuvent être classées essentiellement en deux grands groupes en fonction de leur mode d’attaque :�

• α-amylase :glucanohydrolase (EC 3.2.1.1), action de type endomoléculaire et conduit à la formation de D-glucose, de maltose et d’une petite quantité de maltodextrines.
• Existent chez des genre: Bacillus et Clostridium, de nombreuses moisissures ( Aspergillus et Rhizopus), ainsi que chez quelques levures (Candida, Pichia, Endomycopsis, lipomyces et Schwanniomyces). –
• Glucoamylase ou α (1-4)-glucane glucohydrolase (EC 3.2.1.3):
• libère des unités de glucose à partir des extrémités des polymères.
• Hydrolyse l’amylopectine et l’amylose complètement en D-glucose et est également capable d’hydrolyser les liaisons α (1-6) ainsi que les liaisons α(1-4).
• Elle hydrolyse aussi le maltose.
• Il existe des β-amylases (Bacillus subtilis, quelques moisissures), dont l’action est exomoléculaire. Elle est répandue chez les végétaux et rare chez les microorganismes.

• Cette biomasse constitue une matière première attrayante puisqu'elle est très abondante sur Terre, renouvelable et peu coûteuse.
• Et peut contenir aussi,
• - les sous-produits issus des unités de transformation des produits agricoles alimentaires et non alimentaires : bagasses, tourteaux, …
• - Toutes matières végétales (lignocellulosique) et sous-produits de l'agriculture et de l'élevage: paille, feuilles, tiges, coques, fumier et déchets d’élevage. industries agro-alimentaires, papetières, de transformation du bois, IA.:
• En plus des boues de stations d'épuration) ou des effluents d’élevages
• ,

Biomasse de la deuxième génération

• Les résidus agricoles

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• Les résidus forestiers

• bois de rebut

• Surplus de taillis

• Résidus de culture

• Issu de silo

surplus de paille

bagasse de canne �à sucre

chaume de maïs

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Types de Biomasse de la deuxième génération

• Les résidus des ménagers

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• Les résidus industriels

• Eaux usées de procédés (margines des olives)

• Déchets solides

• Déchets solides

• Eaux usées domestiques

Décharge publique

Station de traitement des eaux usées

Constituants de la paroi végétale:

Importance de de la biomasse :�

1- production du biofuel (ex. ethanol),.�2- source de carbone pour la fermentation

• Les trois constituants majeurs de la biomasse ligno cellulosique sont: cellulose, hémicelluloses et lignine: 45 %cellulose, 30% hemicellulose, 20% lignin, 5% minerals
• Seule la cellulose est aujourd'hui facilement transformable en éthanol; l'hémicellulose fait l'objet de recherches intensives pour la rendre convertible.

• le procédé se déroule en 4 étapes :
• le prétraitement qui dissocie cette biomasse en polymères facilement dégradables,
• l'hydrolyse de ces polymères en sucres simples,
• la fermentation de ces sucres en éthanol par des cellules
• la récupération du bioéthanol par distillation.

TRANSFORMATION DE LA BIOMASSE EN ÉTHNANOL

Procédé de fabrication de l’éthanol par fermentation des sucres (1^ère génération), Adrian ,2011

L'Ethyl Tertio Butyl Ether: L’ETBE est utilisé comme additif à l'essence, à hauteur de 15 %, en remplacement du plomb

Production d’éthanol (2^ème génération) (Oucif ,2017 ; Nunes ,2009)

Constituants de la matière lignocellulosique et les résultats schématiques du procédés

Schémas de procédés pour les deux grandes filières de production mettant en

évidence matières premières, produits et co-produits (Hantson et Thomas,2010).

L'Ethyl Tertio Butyl Ether: L’ETBE est utilisé comme additif à l'essence, à hauteur de 15 %, en remplacement du plomb

De la paille à l’éthanol

Valorisation de la Biomasse lignocellulosique

Pour un meilleur rendement de production d’éthanol :

• Rendement théorique potentiel en éthanol 2000 à 4000 l/ha et / an
• Sélection du matériel végétal
• Pré-traitements du matériel végétal (fractionnement physique, chimique ou enzymatique)
• Conception de cocktails enzymatiques performants R

Limites de la valorisation de la biomasse LGC

• Problématiques du prétraitement :
• • energy consumption,
• degradation of sugars,
• formation of toxic compounds,
• continuous feeding of reactors under pressure, corrosion,
• dry matter concentration: présence de lignine = limitation de la concentration initiale en glucose (teneur en matière sèche limitée) et donc de la teneur finale en éthanol,
• • présence éventuelle de composés toxiques libérés lors du prétraitement,
• • les sucres à 5 atomes de carbone issus des hémicelluloses ne sont pas convertis efficacement en éthanol.
• Nécessite des souches modifiées et améliorées •

EXEMPLES DES MICROORGANISMES UTILISÉS EN PRODUCTION D’ALCOOL PAR FERMENTATION

(Lin et

Tanaka, 2006)

• Gain financier
• Economie d’énergie et … d’argent par l’utilisation de technologies matures et compétitives dans certains contextes (chaudières à biomasse)

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• Résolution de problèmes environementaux ou de santé publique
• Elimination des boues issues des stations de traitement des eaux usées
• Elimination des margines issues des huileries d’oilves

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Intérêt de la bioénergie : gain financier

• Les microorganismes les mieux adaptés à la production d’éthanol à partir de sucres fermentescibles sont les levures du genre Saccharomyces:
• (Sanchez et al.,1999; Fennouche, 2017, Oucif, 2017, Boulal, 2017) et Kluyveromyces (Limtong et al., 2007) et la bactérie Zymomonas (Pinilla et al., 2011 ; Bai et al., 2008; Patle et al., 2008) .

Comprend les lipides de micro algues:

Certaines micro-algues sont capables de synthétiser des lipides ou des

hydrocarbures à partir du CO2 avec une productivité potentiellemen t supérieure à celle des productions oléagineuses avec les meilleurs rendements, rendant ainsi envisageable une production de masse (par exemple pour l'aviation), sans déforestation massive ni concurrence avec les cultures alimentaires.

Biomasse de la troisième génération

Biomasse de troisième génération (cultures d’algues )( Vaitilingom ,2013 ; Touati,2013).

Cinétique microbienne et enzymatique

• Les taux de biosynthèse sont basés sur un temps de division cellulaire.
• E. coli: 20 min
• Thiobacillus ferrooxidans: 6.5 et 17 heure

La capacité biosynthétique d'une cellule bactérienne d'Escherichia Coli

Cinétique microbienne (modélisation)

• Difficulté de modeling de la biocinétique de croissance microbienne:
• plusieurs chemins métaboliques.
• réactions secondaires importantes pour la vie des cellules bactériennes.
• Les complications majeures du modeling viennent du fait que plusieurs mécanismes de réaction du métabolisme de la cellule sont complètement inconnus.
• Les facteurs influençant la croissance bactérienne sont nombreux et la connaissance biologique et les outils mathématiques nécessaires à la formulation et l'étude d'un modèle général et complet n'existent pas encore.

Bière, vin, vinaigre, yogourt, pénicilline, acide lactique, biogaz, éthanol, glycérine, … quelle relation peut-il bien exister entre tous ces produits ?�De même, quel point commun pourrait-on trouver entre l'activité principale du boulanger - fabriquer du pain - et le fonctionnement d'une station d'épuration �

La fermentation : Microorganisme, fermenteur substrat, produit

• Le bioréacteur (ou digesteur ou fermenteur), partie maîtresse de l'installation, consiste en:
• une enceinte plus ou moins vaste (de quelques litres en installation de�laboratoire, quelques dizaines de litres en installation pilote ou de préculture, à plusieurs mètres-cubes en production industrielle.) .
• conçue pour optimaliser les contacts biomasse-substrat-oxygène.
• en vue de maximiser le rendement de la (des) réaction(s) biochimique(s) recherchée(s).
• Ces contacts doivent permettre un transfert idéal:
• d’une part, des substances nutritives en solution dans le substrat vers�le cytoplasme cellulaire.
• d'autre part, des produits de l'activité microbienne vers le�milieu extra-cellulaire. �

Fermenteur: Nécessité de régulation

• Maintenir constantes les conditions de travail par:
• • mesurer, si possible en temps réel, la valeur des principales variables (T°, pH, concentrations, débit d'O 2, ...) susceptibles d'interférer avec le fonctionnement de la biomasse ;
• • disposer d'un moyen de corriger le plus rapidement possible les caractéristiques de la réaction en cours.
• Lutte contre les sources d'infection et la protection hygiénique du digesteur
• concevoir des moyens de séparer le produit intéressant du reste sans l'endommager et en lui assurant une pureté compatible avec son utilisation � �

Les différents éléments d'un bioréacteur

• La cuve Les cuves sont en verre jusqu'à 20 L, en acier inoxydable au-delà.
• Leur fond est généralement rond.
• Les cuves doivent résister:
• aux sollicitations thermiques, lors de la stérilisation,
• aux vibrations, résultant de l'agitation,
• aux surpressions de gaz, lors de la stérilisation et de la vidange,
• à la corrosion.
• Les cuves doivent être étanches aux contaminations extérieures, et supporter les additions d'acides, de bases, d'anti-mousses.
• Le volume utile (volume de milieu) est généralement = ¾ du volume de la cuve, pour tenir compte de l'augmentation de volume due à l'injection d'air et à la formation de mousse.

Le système d'aération

• Le bioréacteur doit posséder un système d'injection d'air qui doit être dispersé dans l'ensemble du milieu.
• L'arrivée d'air a lieu sous le mobile d'agitation. L'air doit être :
• comprimé (compresseur),
• stérile donc filtré (cad dépourvu de particules). On utilise un filtre hydrophobe qui conserve ses propriétés stérilisantes à l'humidité atmosphérique.
• Ne pas autoclaver n'y faire entrer de l'air humide car risque d'occlusion,
• sec (pour ne pas mouiller le filtre),
• Déshuilé,
• Le système de distribution et de répartition de l’air peut être un simple tube d'arrivée d'air, un tube métallique perforé (sparger linéaire), un plateau d'aération ou disque de porcelaine poreux qui disperse bien le gaz

Milieux de culture

• Chaque milieu doit être complet et fournir
• -Une source de carbone et d’énergie (glucose, amidon, mélasse, huiles…) ;
• -Une source d’azote (sels d’ammonium ou de nitrate, acides aminés, farine de soja, peptone, extrait de levure…) ;
• -Des sels minéraux (Mg, P, S, Cl…) ;
• -Des oligo-éléments (Fe, Zn, Mn, Ca, Co…). Ces éléments sont présents en concentrations faibles (non optimale) dans les substrats naturels complexes.
• Dans certains cas, il est nécessaire d’ajouter des facteurs de croissance (acides aminés ou vitamines).

• Des milieux de propagation de composition qualitative proche du milieu de production permettent de réduire la phase de latence, et donc de diminuer les temps d’incubation,
• les milieux de propagation contiennent des substrats naturels : extrait de malt, extrait de levure, peptone, caséine…),

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Travail personnel

• Résumer l’article:
• “Strategies for Fermentation Medium Optimization: An In-Depth Review”  Singh et al., 2017
• Front. Microbiol., 06 January 2017�Sec. Microbiotechnology�https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.02087,
• Les parties à résumer:
• Nutritional Control of Metabolite Production
• �Need of Medium Optimization
• Classical Medium Optimization Methods
• Problems and Bottle Necks in Medium Optimization Techniques

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• ��

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Fonctionnement du fermenteur

• Cinq procédés sont utilisés :
•  Le batch = discontinu
• Le fed-batch = discontinu alimenté
• La culture continue
• Le recyclage cellulaire = système de perfusion
• L’immobilisation cellulaire

Les cultures discontinues constituent un système clos = pas d’ajout d’éléments (X, S, P) au milieu.

⮲ En pratique :

La culture se fait en flacons (erlen) ou en bioréacteurs

Dès le début, on apporte toute la quantité de substrat nécessaire au déroulement du procédé, donc on a une forte concentration en substrat dans le milieu en début de campagne.

Le milieu de culture est favorable à la croissance : température, pH optimaux pour le microorganisme

La croissance se développe jusqu'à :

• épuisement d'un nutriment essentiel (carence)
• une modification importante de l'environnement : changement de pH, accumulation d'un produit toxique

⮲ Bilan :

Les conditions de culture changent en permanence : X augmente jusqu’à X max, S diminue, P augmente….

Les cultures discontinues (Batch)

LES PARAMETRES D’ETAT CONCERNANT L’UTILISATION DES biomasse (x)/SUBSTRATS/ (s)produits (p)/�

• L’augmentation du nombre de la population microbienne est toujours par la puissance 2^n,
• n est le nombre des generations
• après 6 generations le nombre des cellules deviedras :
• 2⁶ = 64
• après 20 generations = 2²⁰ = 1,048,576
• Ceci peut etre exprimé par l’équation
• N_t = N₀ x 2ⁿ

Temps de génération

• Après un doublement (t=tg), on aura x₁=2 x₀ individus ;
• après deux doublement (t=2 tg) on aura

x₂=2 .2 x₀ = 2²x₀ individus

après n doublement (t=n tg) on aura x_n=2ⁿ x₀ individus

Expression mathématique de la croissance

• Exprimée par: la masse cellulaire ou par le nombre cellulaire (x) /(N).
• Le taux de changement de la biomasse en fonction du temps peut s’exprimier par :
• dx/dt = μx ——————1.1
• μ=(1/x).dx/dt ——————1.2
• x= concentration de la biomasse (g/l)
• μ= taux de croissance spécifique(h-1)
• t= time (h)

​

Expression mathématique de la croissance

• En faisant l’ integration de l’equation 1.1 (dx/dt = μx ——————1.1)
• xn=x0e^μt ——————1.3: L’équation exponentielle de la croissance
• xn= concentration de la biomasse après le temps t (g/l)
• x0= concentration de la biomasse au debut de la phase exponontielle.
• Application du log natural, loge (ln) de l’équ 1.3
• lnxn=lnx0+μt ——————1.4
• μ = (lnxn - lnx0)/t ——————1.5

​

Mathematical Expression of Growth

Expression mathématique de la croissance

Calcule graphique du temps de du doublement du nombre cellulaire “temps de generation”

• Considérant le nombre initial de la biomasse est : xo, et après un certain temps (t), ce nombre se double.
• xn=2xo
• Ce temps (t) est le temps de generation G ou tg .
• Remplacant ces valeurs dans l’equation. (3.1): xn=x0e^μt
• 2xo = xoe^μtg ——————3.1
• log de l’eqn. 3.1
• ln2xo = lnxo + μtg ——————3.2
• μtd = ln2 ——————3.3
• tg = ln2/μ ——————3.4 G= ln2/μ

​

Récapitulation du procédé de fermentation industrielle

• Les procédés de culture fed-batch permettent d’apporter le substrat en plusieurs fois, ils sont utilisés dans 2 cas de figure :
• 1- orsque le substrat à forte concentration est inhibiteur de la croissance.
• Il faut donc apporter le substrat au fur et à mesure qu'il est consommé afin d'éliminer ou de limiter l'effet inhibiteur du substrat, tout en maintenant une productivité maximum pendant le plus de temps possible.
• 2- Lorsque le substrat à forte concentration entraîne un changement de métabolisme = effet Crabtree
• ex avec E.coli lorsque la concentration en glucose dans le milieu est forte, la synthèse des enzymes respiratoires est inhibée, le métabolisme est orienté vers la voie fermentative et parallèlement les enzymes de la fermentation sont induites. Alors que lorsque la concentration en glucose est faibles dans le milieu la synthèse des enzymes respiratoires est active, le métabolisme oxydatif est actif et caractérisé par un rendement énergétique fort.

• Culture discontinue alimentee = fed batch

⮲ En pratique :�

• - on rajoute du substrat concentré en faible volume et on peut éventuellement fixer une consigne sur S avec une régulation automatique.

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Ajout milieux

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Retrait milieux et biomasse

• Principe 

La culture continue est un système ouvert dans lequel la concentration en biomasse X et les concentrations en éléments du milieu S et P sont maintenues constantes en retirant une partie de la culture et en la remplaçant par du milieu frais.

Ajout milieu / Retrait milieu + biomasse

Volume de la culture constant / X constant / P et S constants

• CULTURE CONTINUE

• ⮲ En pratique :
• il faut un moyen de contrôle pour maintenir le volume de culture constant, il en existe 3 types :
• 1-la plus simple consiste en un siphon de trop plein avec une pompe à vide
• 2-deux pompes fonctionnant à vitesse égale:
• une pour retirer une partie de la culture
• une pour introduire du milieu neuf : difficile en pratique car il y a toujours une légère différence de fonctionnement (débit) entre les pompes,
• 3une balance pour peser le bioréacteur tout au long du procédé et qui déclenche la pompe de sortie dès que la masse du bioréacteur augmente.
• ⮲ Bilan :
• Les conditions de culture sont maintenues constantes : X, S, P sont constants, on parle de régime permanent.

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• Les deux procédés de culture en continue disponibles avec des contrôles du taux de croissance différents

On a 2 procédés disponibles pour faire du continu : le chémostat et le turbidostat

• Le chémostat

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• Le chémostat est la plus fréquente des cultures continues.
• Le chémostat est un procédé qui permet d'ajuster automatiquement le taux de croissance à la dilution en faisant varier le débit

​

• ��

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1-2-2- 2- Principe de fonctionnement du chemostat

• Introduction de milieu neuf stérile dans la chambre de culture à la même vitesse que le milieu contenant les micro-organismes est éliminé (c’est le volume de milieu frais qui chasse par trop plein le volume de culture microbienne).
• Conséquences :
• stabilité de concentration en substances nutritives limitantes
• microorganismes soumis à une bonne aération, à une vigoureuse agitation et ayant toujours à leur disposition les éléments nutritifs dont ils ont besoin

67

Multiplication maintenue exponentielle à une vitesse spécifique de croissance rigoureusement contrôlée par l’apport de milieu neuf.

Dans un chémostat, du milieu de culture neuf est apporté à un débit constant tandis que le réacteur (homogénéisé) est délesté de son contenu au même débit exactement.

​

• En pratique, avec un fermenteur de laboratoire, on peut réaliser l'égalité exacte du débit d'alimentation et du débit effluent à l'aide de 2 pompes et d'un tube d'effluent "plongeur au niveau souhaité".
• Autre procédé, très appliqué pour les installations d'assez gros volume: l'effluent est soutiré par gravité lors du déclenchement d'une électrovanne pilotée par le poids - à maintenir constant - du bioréacteur.

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Le chémostat

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Principe de fonctionnement du chemostat

• Introduction de milieu neuf stérile dans la chambre de culture à la même vitesse que le milieu contenant les micro-organismes est éliminé (c’est le volume de milieu frais qui chasse par trop plein le volume de culture microbienne).
• Conséquences :
• stabilité de concentration en substances nutritives limitantes
• microorganismes soumis à une bonne aération, à une vigoureuse agitation et ayant toujours à leur disposition les éléments nutritifs dont ils ont besoin

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Multiplication maintenue exponentielle à une vitesse spécifique de croissance rigoureusement contrôlée par l’apport de milieu neuf.

Le turbidostat

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Le turbidostat

• – cellule photoélectrique reliée à la vanne d’entrée de milieu neuf ce qui permet via un système électronique une autorégulation du débit en fonction de la concentration de la biomasse mesurée en sortie.
• Source lumineuse : photodetecteur

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Principe de fonctionnement du turbidostat

• Un turbidostat est un dispositif de culture en continu. La concentration du milieu de culture est maintenue constante par un contrôle turbidimétrique.
• Si le trouble tend à trop augmenter il y a une augmentation d’apport de milieu neuf qui dilue et ramène le trouble à sa valeur initiale.
• Si le trouble tend à trop diminuer il y a diminution d’apport de milieu neuf jusqu’à ce que la croissance ait permis de retrouver la valeur initiale

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1-2-3- Avantages et inconvénients de la culture en continu

Avantages

• Maintien de la phase exponentielle : rendement optimal
• Stérilisation facile du milieu
• Récupération des produits au fur et à mesure de leur production

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Inconvénients

• Difficulté du contrôle du système de régulation
• Difficulté du maintien d’une culture pure
• Pas de possibilité de fabrication de produits libérés uniquement durant la phase de déclin.

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• L’augmentation du nombre de la population microbienne est toujours par la puissance 2^n,
• n est le nombre des generations
• ∴ après 6 generations le nombre des cellules deviedras :
• Population = 2⁶ = 64
• après 20 generations = 2²⁰ = 1,048,576
• Ceci peut etre exprimé par l’équation Nt = N0 x 2ⁿ

Temps de génération

• Après un doublement (t=tg), on aura n₁=2 n₀ individus ;
• après deux doublement (t=2 tg) on aura

n₂=2 .2 n₀ = (2²n₀)

individus = ; après n doublement (t=n tg) on aura x_n=2n x₀ individus

Expression mathématique de la croissance

• Exprimée par: la masse cellulaire ou par le nombre cellulaire (x) /(N).
• Le taux de changement de la biomasse en function du temps peut s’exprimier par :
• dx/dt = μx ——————1.1
• μ=(1/x).dx/dt ——————1.2
• x= concentration de la biomasse (g/l)
• μ= taux de croissance spécifique(h-1)
• t= time (h)

​

Expression mathématique de la croissance

• En faisant l’ integration de l’equation 1.1 (dx/dt = μx ——————1.1)
• xn=x0e^μt ——————1.3: L’équation exponentielle de la croissance
• xn= concentration de la biomasse après le temps t (g/l)
• x0= concentration de la biomasse au debut de la phase exponontielle.
• Application du log natural, loge (ln) de l’équ 1.3
• lnxn=lnx0+μt ——————1.4
• μ = (lnxn - lnx0)/t ——————1.5

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Mathematical Expression of Growth

Expression mathématique de la croissance

Calcule graphique du temps de du doublement du nombre cellulaire “temps de generation”

• Considérant le nombre initial de la biomasse est : xo, et après un certain temps (t), ce nombre se double.
• xn=2xo
• Ce temps (t) est le temps de generation G ou tg .
• Remplacant ces valeurs dans l’equation. (3.1): xn=x0e^μt
• 2xo = xoe^μtg ——————3.1
• log de l’eqn. 3.1
• ln2xo = lnxo + μtg ——————3.2
• μtd = ln2 ——————3.3
• tg = ln2/μ ——————3.4 G= ln2/μ

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