1 of 34

ІНСТРУМЕНТИ МОЛЕКУЛЯРНОЇ ДІАГНОСТИКИ АФРИКАНСЬКОЇ ЧУМИ СВИНЕЙ В�СИСТЕМІ ПРОГНОЗУВАННЯ ЗАХВОРЮВАННЯ�

Національна академія аграрних наук

Національний науковий центр

“ Інститут експериментальної і клінічної

ветеринарної медицини ”

Доповідач: заступник директора ННЦ “ІЕКВМ” з наукової роботи

завідувач відділу молекулярної епізоотології

та діагностики, доктор ветеринарних наук, професор

А.П. Герілович

​

2 of 34

На сьогоднішній день з-поміж різноманітних діагностичних тестів у гуманній та ветеринарній медицині дедалі ширшої популярності та значимості набувають молекулярно-генетичні методи (генодіагностика) – полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), рестрикційно-ензимний аналіз, електрофорез в пульсуючому полі, секвенування специфічних ділянок геному.

2

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

3 of 34

  • надзвичайно висока

чутливість (визначення РНК та ДНК збудника у біологічних та патологічних матеріалах при наявності 200-1000 бактеріальних клітин або віріонів в пробі, діагностична чутливість 90-100 %),

  • експресність (тривалість аналізу 8-12 годин),
  • можливість проведення групових досліджень,
  • специфічність �(діагностична – 95 %).

​

ПЕРЕВАГИ МОЛЕКУЛЯРНО-

ГЕНЕТИЧНИХ МЕТОДІВ

3

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

4 of 34

МЕТОДИ МОЛЕКУЛЯРНОЇ ДІАГНОСТИКИ ТА МОЛЕКУЛЯРНОЇ ЕПІЗООТОЛОГІЇ (ЕПІДЕМІОЛОГІЇ)

  • Полімеразна ланцюгова реакція:
  • - діагностика інфекційних та інвазійних хвороб;
  • - генотипування збудників;
  • - діагностика неінфекційних хвороб;
  • - експертиза кормів та продуктів харчування;
  • - судмедекспертиза;
  • - інструмент для більш точних досліджень;
  • - інструмент для отримання синтетичних генів

​

4

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

5 of 34

ЗАСТОСУВАННЯ ПЛР У ВЕТЕРИНАРНІЙ МЕДИЦИНІ

  • ПЛР означена як скринінг-тест для моніторингу та постановки первинного діагнозу при АЧС, КЧС, хворобі Ауєскі, лістеріозі, бешисі, хламідіозі, РРСС, ЦВІС, ПВІС тощо (O.I.E. Manual, 2008).
  • ПЛР є рекомендованим тестом для діагностики ІРТ та блутангу і додатковим при дослідженні щодо носійства вірусу лейкозу ВРХ (O.I.E. Health code, 2006).
  • ПЛР є зручним тестом для контролю тваринницької сировини при імпортних та експортних товарообмінах (W.T.O., 2004 (U.S.)).
  • Тест застосовують для контролю контамінації патогенними вірусами та бактеріями об'єктів ветеринарного і біотехнологічного нагляду (Pharm Biotech, 2007, IHC).

​

5

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

6 of 34

ЕМЕРДЖЕНТНІ ХВОРОБИ СВИНЕЙ�АФРИКАНСЬКА ЧУМА СВИНЕЙ

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

6

  • Потребує встановлення експрес-діагнозу
  • Потребує контролю в дикій природі
  • Потребує контролю в членистоногих векторах

7 of 34

БІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ЗБУДНИКА АФРИКАНСЬКОЇ ЧУМИ СВИНЕЙ

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

7

  • Збудником АЧС є ДНК-вміщуючий асфарвірус
  • Геном збудника представлений дволанцюговою ДНК довжиною в середньому 170 т.п.н.

8 of 34

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

8

9 of 34

БІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ЗБУДНИКА АФРИКАНСЬКОЇ ЧУМИ СВИНЕЙ

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

9

  • Геном вірусу АЧС містить 125 т.п.н. константну ділянку та право- та лівосторонню області варіабельних генних мультикомплексів, що представлені відповідними ділянками, які комплексно кодують вірусні протеїни, відповідальні за патогенез АЧС та формування імунної відповіді
  • Секвенування MGF 360 та 505/530 дозволяє визначити видоспецифічність (тропізм до відповідного виду свиней та тканин їх організму), а також рівень патогенності збудника

10 of 34

БІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ЗБУДНИКА АФРИКАНСЬКОЇ ЧУМИ СВИНЕЙ

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

10

  • Генетична спорідненість вірусу вказує на наявність 22 генотипів, які підрозділяються умовно на дві геногрупи
  • Маркерною генотип-специфічною областю є р72-область
  • Прогенітором першої генетичної лінії є кластери збудників генотипу 1, що циркулювали в Африці та країнах Європи у 50-60-ті роки, а другої – карибські ізоляти генотипу 8 70-х років
  • На сьогодні на території Кенії та Уганди, за даними моніторингу серед бородавочника та популяцій кліщів циркулюють вірусу генотипів IX та X

​

11 of 34

ЕВОЛЮЦІЯ ВІРУСУ АЧС (МОЛЕКУЛЯРНІ ЧАСИ)

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

11

12 of 34

ПОШИРЕННЯ ОКРЕМИХ ГЕНОТИПІВ ВІРУСУ АЧС

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

12

13 of 34

МОЛЕКУЛЯРНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВІРУСУ АЧС В ГРУЗІЇ

  • Спалахи АЧС в

Грузії зумовлені �вірусом генотипу 2

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

13

14 of 34

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

14

15 of 34

ПРОГНОЗ ПОШИРЕННЯ АЧС…

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

15

16 of 34

17 of 34

МОЛЕКУЛЯРНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВІРУСУ АЧС�(BY J. FERNANDEZ-PINERO)

17

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

18 of 34

АЧС В УКРАЇНІ

​

  • 1977 - Одеса
  • 2012 Запоріжжя
  • 2014 Схід України
  • Всього 323 сталахів серед дикої фауни та домашніх свиней

18

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

19 of 34

СИСТЕМА ОЦІНКИ РЕГІОНАЛЬНИХ РИЗИКІВ (НАПР. РФ ДЛЯ СХІДНОГО РЕГІОНУ УКРАЇНИ)

Фактор ризику

Високий

Середній

Низький

Наявність хвороби з-поміж дикої фауни

+

​

​

Наявність хвороби серед свійських тварин

+

​

​

Наявність векторів переносу

?

​

​

Наявність шляхів транскордонного заносу (міграція свійських/диких тварин

+

​

​

Транспортні комунікації (міграція людей)

​

+

3+3+2+3+2= 14

Екстрем. Ризик

(доведений)

19

20 of 34

ASF - STOP meeting in Tallinn, 28th Feb. 2018

20

21 of 34

ЗРАЗКИ МАТЕРІАЛУ �ДЛЯ ДОСЛІДЖЕНЬ

  • Сироватка крові
  • Стабілізована кров
  • Лімфатичні вузли
  • Селезінка
  • Мигдалики
  • Легені
  • Печінка
  • Нирки

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

21

22 of 34

ДЕТЕКЦІЯ ГЕНОМУ ВІРУСУ АЧС

  • Геном представлений дволанцюговою суцільною ДНК довжиною 170 т.п.н.

​

​

  • Індикація вірусу за

протоколом МЕБ (2010)

  • 5’-ATGGA-TACCG-AGGGA-ATAGC-3’
  • 5’-CTTAC-CGATG-AAAAT-GATAC-3’

​

  • Продукт 278 п.н.

Лабораторія молекулярної епізоотології та діагностики. 27.04.2011 р.

22

pBlunt_ASF

1000

2000

3000

4000

Psh

AI 91

Bst

API 316

Acc

III 469

Pst

I 653

Eco

RV 658

674

Not

I

Xho

I

Xba

I

Eco

O109I

Apa

I

Psp

OMI

699

Pvu

I 851

Sna

BI 882

Bsi

WI 884

Tat

I 944

Bsr

GI 944

Xcm

I 1479

Bcl

I 1511

Bsr

DI 1896

II 2185

Rsr

I 2536

Sfi

HII 2579

Bss

I 2585

Zra

II 2585

Aat

I 2631

Sma

I 2631

Xma

AI 2656

Sgr

AI 2706

Sex

I 2814

Fse

III 2891

Dra

I 2942

Dra

I 3699

Pci

4100

dIII

Hin

65I

Acc

I

Kpn

I

Sac

ICRI

Eco

I

Spe

4124

ASF

ccdB(noATG)

Kan(R)

Zeo(R)

23 of 34

МОЛЕКУЛЯРНА ДІАГНОСТИКА

  • Виявлення вірусу в тканинах за методом in situ гібридизації та FISH-детекції�
  • Виявлення вірусного геному методом ПЛР�- Класична ПЛР,�- ПЛР у реальному часі,�- Мультиплексна ПЛР,�- ПЛР-ПДРФ,�- сиквенс-ПЛР

​

Bastos, Penrith, Cruciere, et al. Arch Virol. 2003 148(4):693-706. �Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterisation.�

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

23

24 of 34

МОЛЕКУЛЯРНА ДІАГНОСТИКА АЧС

  • ПЛР за:
  • King (2003)
  • Fernandez (2010)
  • Tington
  • Szak
  • Ін.

​

  • Доробок ННЦ «ІЕКВМ»:
  • Адаптовані методики детекції ДНК (King (2003) та Fernandez (2010)) у формі тест-системи Sui-DNA-test-ASF
    • Рекомбінантний контрольний зразок вірусу АЧС
    • Методики виділення ДНК вірусу з акарологічного матеріалу

​

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

24

25 of 34

African Swine Fever 2006

25

26 of 34

МІЖНАРОДНА ВАЛІДАЦІЯ МЕТОДІВ МОЛЕКУЛЯРНОЇ ДІАГНОСТИКИ АЧС

  • Створені системи молекулярної діагностики та генотипування вірусу відповідають вимогам МЕБ-ФАО та референс-лабораторії ЄС з АЧС
  • Вони пройшли профтестування у референс-лабораторії МЕБ у Іспанії (CISA), США (FADS ARS USDA), центрі МЕБ з впровадження молекулярно-генетичних методів

26

27 of 34

ПРАВИЛА ВІДБОРУ ЗРАЗКІВ

  • Змінені органи та тканини, в яких може бути присутній збудник (5 г) від трупів та вимушено забитих (1-5 гол) – дослідж. 1-2 пули.
  • Кров (стаб. цитратом натрію або трилоном Б) – 3-5 мл, 5-10 гол. з групи – дослідж. 1-2 пули
  • Транспортування – до 18 годин від відбору

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

27

28 of 34

ПРАВИЛА ЗБЕРІГАННЯ ТА ТРАНСПОРТУВАННЯ ЗРАЗКІВ

  • 4С - до 18 годин від відбору, -20С – до двох діб (ДНК-інфекції), розморожування одноразове
  • Транспортування: лід (6 год) та сухий лід (до 2 діб)

​

  • До зразків неможна додавати антибіотики та антикоагулянти на зразок гепарину!!!

​

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

28

29 of 34

  • У ННЦ «ІЕКВМ» розроблена, �впроваджена та функціонує �система управління якістю �згідно ДСТУ ISO 17025 �з 2015 року
  • ННЦ «ІЕКВМ» отримав Атестат �про акредитацію за № 2Н1327 �від 14 серпня 2017 року, який засвідчує компетентність Випробувального

Центру Інституту відповідно до сфери акредитації ДСТУ ISO/IEC 17025:2006 (ISO/IEC 17025:2005)

29

30 of 34

МАРКЕТИНГОВА ПОЛІТИКА

  • Пулові дослідження (скринінг) або індивідуальні дослідження діагностика та перевірка ефективності лікування і профілактики
  • Найнижча вартість досліджень при найбільшому спектрі тестів в Україні
  • Знижки при великих обсягах досліджень
  • Індивідуальне відношення до кожного клієнта
  • Сервісний комплекс (розробка комплексних систем оздоровлення при інфекційних і незаразних хворобах та їх ветеринарний супровід)

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

30

31 of 34

​

Для практики ветеринарної медицини ННЦ “ІЕКВМ” розроблено методики виявлення збудників інфекційних хвороб свиней:

  • АЧС,
  • КСЧ,
  • ТГЕС,
  • РКВС,
  • тешенська хвороба,
  • РРСС,
  • ЦВІС,
  • ПВІС,
  • хвороба Ауєскі
  • туберкульоз (з можливістю видової ідентифікації мікобактерій), хламідіоз,
  • лептоспіроз,
  • гемофільоз,
  • бешиху,
  • актинобацильоз,
  • мікоплазмози (ЕПС) тощо

ВПРОВАДЖЕННЯ ПЛР

31

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

32 of 34

ЛАБОРАТОРІЯ МОЛЕКУЛЯРНОЇ ЕПІЗООТОЛОГІЇ ТА ДІАГНОСТИКИ �ННЦ “ІЕКВМ” ТАКОЖ ПРОПОНУЄ

  • Діагностичні дослідження щодо скринінгу вірусоносійства у скотарстві та птахівництві
  • Оцінку якості та безпечності генетичних ресурсів (сперми ВРХ, ДРХ, свиней)
  • Оцінку санітарного становища тваринницьких приміщень та інкубаторіїв

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

32

33 of 34

???

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"

33

34 of 34

ДЯКУЄМО ЗА УВАГУ!

  • Лабораторія молекулярної епізоотології та діагностики,
  • ННЦ “Інститут експериментальної і

клінічної ветеринарної медицини”

​

​

​

34

Герілович А.П. ННЦ "ІЕКВМ"