2 of 35

Референтные интервалы vs Пороговые значения

	Референсные интервалы	Пороговые значения
Количество значений	Два значения — верхний и нижний предел	Одно значение для конкретной клинической ситуации
Предназначение	Биологическая характеристика популяции	Принятие клинического решения
Применимо	Общая популяция	Клиническая популяция
Влияющие факторы	Популяция, пол, возраст и др. источники вариации	Клиническая задача Категория пациентов
Происхождение	95% центральный диапазон референтного распределения, определяемый статистическими методами	Консенсус экспертов на основе исследований клинических исходов с определением распространенности патологии, ROC-кривых и предсказательной ценности
Кто определяет	Специалисты лабораторной службы	Клиницисты и лабораторные эксперты в клинических рекомендациях
Ведущие эксперты	Специалисты лабораторной службы	Клиницисты

3 of 35

Способы разработки референсных интервалов

Прямой

Прямой поиск, вовлечение и учет лиц для получения результатов исследования

Непрямой

Использование результатов, имеющихся в лаборатории, для получения массива данных, отражающих состояние популяции в целом.

4 of 35

Этапы исследования (прямой метод)

Данные литературы
Критерии включения/исключения
Количество референтных индивидуумов
Информированное согласие на участие в исследовании и заполнение анкеты
Проверка отобранных потенциальных референтных индивидуумов по данным анкеты
Подгруппы референтных индивидуумов
Подготовка отобранных участников к взятию биоматериала
Сбор и обработка образцов.
Определение референтных значений
Гистограмма реф-х значений и оценка распределение данных
Идентифицируйте возможные ошибки и/или выпадающие значения
Проанализируйте референтные значения: выберите статистический метод и рассчитайте референтные пределы и доверительные интервалы.

1. На основе данных литературы проанализируйте возможные факторы биологической и аналитической вариации для исследуемого аналита.

2. С учетом этих данных определите критерии включения/исключения и отразите это в анкете для участников исследования.

3. Установите для данного аналита требуемое количество референтных индивидуумов в зависимости от предполагаемого статистического метода расчета

пределов РИ, в том числе для каждой из подгрупп в случае возможного деления РИ по подгруппам.

4. Подпишите у предполагаемых участников информированное согласие на участие в исследовании и соберите заполненные анкеты.

5. Проверьте отобранных потенциальных референтных индивидуумов по данным анкеты на предмет соответствия заранее определенным критериям включения/исключения. Исключите, если необходимо.

6. В случае ожидаемого деления РИ на подгруппы сформируйте подгруппы референтных индивидуумов на основе данных анкеты.

7. Подготовьте отобранных участников к взятию биоматериала в соответствии с процедурой, обычно используемой в лаборатории.

8. Соберите и обработайте образцы.

9. Определите РЗ: анализируйте образцы с использованием хорошо проверенных и контролируемых методов.

10. Постройте гистрограмму РЗ и оцените распределение данных.

11. Идентифицируйте возможные ошибки и/или выпадающие значения.

12. Проанализируйте РЗ: выберите статистический метод и рассчитайте референтные пределы и доверительные интервалы.

13. Документируйте все шаги и процедуры.

5 of 35

Подходы к исключению добровольцев

Исключение лиц происходит до взятия биоматериала, т.е. по данным анкетирования

A priori

Исключение лиц после взятия или исследования образцов от референтных лиц

A posteriori

6 of 35

Мотив для разработки референтного интервала?

Исследование новых аналитов
Исследование известных аналитов с использованием нового оборудования или методики
Перенос референтного интервала из другой лаборатории

7 of 35

Цель

Разработка референсных интервалов общего анализа мочи, с использованием методов «сухой химии» и автоматизированной микроскопии на анализаторе FUS-2000

8 of 35

Материалы и методы

546 доброволец
Средний возраст 39 лет
Распределение по полу 72% женщины, 28% мужчины

9 of 35

Анкетирование

Паспортная часть
Соматический статус
Принимаемые ЛС, БАДы, витаминные комплексы
Вредные привычки
Спорт/фитнес
Беременные/менструации
Режим питания/диеты

10 of 35

Статистическая обработка результатов

Оценка типа распределения данных
Анализ наличия выпадающих значений
Выбор статистического метода
Параметрический – нормальное распределение;
Непараметрический –распределение отличное от нормального
Расчет одностороннего/ двухсторонних референтных пределов с 90% доверительным интервалом

11 of 35

Стандартизация лабораторных этапов

Преаналитический этап

Долабораторный: инструктаж референтных лиц
Лабораторный: применение критериев качества преаналитического этапа

Аналитический этап

ежедневное техническое обслуживание оборудования
ежедневный контроль качества
проведение исследований квалифицированным персоналом

12 of 35

Гибридный мочевой анализатор FUS-2000

Классическая «сухая» химия
Режим исследования осадка
Ежедневный контроль качества

13 of 35

Исследование осадка

Kayani AA, Khoshmanesh K, Ward SA at al. Optofluidics incorporating actively controlled micro- and nano-particles. Biomicrofluidics. 2012 Jul 18;6(3):31501.

Монослой частиц
Технологиях захвата изображения
Получение изображения
Программная классификация

Когда образец для анализа помещается в емкость, впрысскивающий насос вносит жидкость проточную в туже емкость, происходит смешивание, происходит распределение жидкости по мономолекулярной пленке, далее фотографирование с помощью технологии быстрого захвата изображения.

Оболочный поток — широко используемый метод для различных применений, включая, помимо прочего, подсчет частиц, проточную цитометрию, волноводство и контроль жидкости. Оболочное течение предполагает окружение центрального потока потока (ядра) окружающим потоком (оболочкой). При подсчете частиц и проточной цитометрии оболочка предотвращает контакт частиц в ядре со стенками канала, тем самым предотвращая прилипание и засорение. Оболочка также служит для фокусировки частиц или молекул в центре канала, что позволяет легко подсчитывать или измерять их с помощью оптических или других средств. Оболочный поток обычно представляет собой ламинарный поток, который по существу позволяет избежать смешивания стержневого потока и наружного потока.

14 of 35

Исследование осадка

15 of 35

Аналитические характеристики

Аналиты	Чувствительность	Рабочий диапазон
Глюкоза (ммоль/л)	До 2,8-5,6	Отр. – 56
Белок (г/л)	До 0,2-0,3	Отр. – 3,0
Кетоны (ммоль/л)	До 0,5-1,0	Отр. – 7,8
Кровь (кл/мкл)	До 5-15	Отр. – 200
Билирубин (мкмоль/л)	До 8,6-17	Отр. – 103
Нитриты (мкмоль/л)	До 13-22	Отр. – полож.
Лейкоциты (кл/мкл)	До 5-15	Отр. – 500
Уробилиноген (мкмоль/л)	До 3,4-17	3,4 – 135
рН	-	5,0-9,0
Удельный вес	-	1,005-1,030

Глюкоза – глюкозоксидазные метод с обазованием перекиси и окислением кислородом тетраметилбензидина

Билирубин – диазониевая методика

Кетоны – реакция на ацетоуксусную кислоту с нитропруссидом натрия

Кровь – окисление тетраметилбензидина

Лейкоциты – гранулоцитарная эстераза обеспеч гидролиз пирроламинокислого эфира с образование производного пиррола, которое после взаимодейсвтия с диазонием образует продукты пурпурного цвета

Нитриты – основаны на реакция нитритов мочи с ароматическим аминосульфаниламидом, с изменением окраски

Белок – основан на феномене «белковой ошибки индикатора», анион специциального рН-индикатора взаимодействует с катионом белковой молекулы, вызывая дальнейшую ионизацию индикатора и изменение окраски

Уробилиноген – взаимодействие с диазонием в кислой среде приводит к образованию розовых азокрасителей

рН – рН-индикаторы

Удельный вес – электролиты в моче реагируют с полиметилвиниловым эфиром и малеиновой кислотой, при этом образуются протоны водорода, которые меняют окраску индикаторов

16 of 35

Сходимость данных

Сухая химия	CV, %	Автоматизированная микроскопия	CV
Глюкоза (ммоль/л)	0	Эритроциты, в мкл	1,78
Белок (г/л)	0	Лейкоциты, в мкл	3,82
Микроальбумин (г/л)	0	Эпителий пл., в мкл	6,50
Кетоны (ммоль/л)	0	Эпителий переходный/ круглый, в мкл	3,16
Кровь (кл/мкл)	10	Цилиндры, /LPF	0
Билирубин (мкмоль/л)	0	Кристаллы, в мкл	0
Нитриты (мкмоль/л)	0	Бактерии, /HPF	2,35
Лейкоциты (кл/мкл)	0	Слизь, в мкл	1,73
Уроб-ген (мкмоль/л)	0
рН	0
Удельный вес	0,09

17 of 35

Физико-химические свойства

рН (4,50-6,79 при N распределении; 5-7 при отличном от N)

Удельный вес (N –1,001-1,029; no N – 1,001-1,029)

	Нижний предел	Верхний предел
N	4,50	6,79
90% CI	4,43-4,5	6,71-6,85
No N	5,00	7,00
90% CI	5,00-5,00	7,00-7,00

	Нижний предел	Верхний предел
N	1,003	1,030
90% CI	1,002-1,004	1,029-1,031
No N	1,004	1,030
90% CI	1,003-1,004	1,028-1,031

18 of 35

Сухая химия�Белок, глюкоза, кетоны

	РИ		90% нижней границы	90% верхней границы
Белок	0,2-0,2	Отрицательно	-	0,2-0,2
Кетоны	0,0-0,0	Отрицательно	0,0-0,0	0,0-0,5
Глюкоза	2,8-2,8	Отрицательно	2,8-2,8	2,8-5,6

19 of 35

Сухая химия�Эритроциты, лейкоциты

	РИ		90% нижней границы	90% верхней границы
Кровь	5,0 – 8,0	Отрицательно	5,0-5,0	5,0-200
Лейкоциты	5,0-15,0	Отрицательно	5,0-5,0	5,0-15,0

20 of 35

Сухая химия�Билирубин, уробилиноген, нитриты

	РИ		90% нижней границы	90% верхней границы
Уробилиноген	3,4-11,5	Отрицательно	3,4-3,4	3,4-17,0
Билирубин	8,6-8,6	Отрицательно	8,6-8,6	8,6-8,6
Нитриты	13,0-13,0	Отрицательно	13,0-13,0	13,0-22,0

21 of 35

Исследование осадка

Эритроциты (0- 15,25 в мкл)

Лейкоциты (0-22,55 в мкл)

	Нижний предел	Верхний предел
No N	0,00	15,25
90% CI	0,00-0,00	11,00-21,00

	Нижний предел	Верхний предел
No N	0,00	22,55
90% CI	0,00-0,00	18,00-28,00

22 of 35

Исследование осадка

Плоский эпителий (0-26,55 в мкл)

Круглый/переходный эпителий (0-0 в мкл)

	Нижний предел	Верхний предел
No N	0,00	26,55
90% CI	0,00-0,00	22,00-41,00

	Нижний предел	Верхний предел
No N	0,00	1,00
90% CI	0,00-0,00	1,00-1,00

23 of 35

Исследование осадка

Плоский эпителий (0-58 в мкл)

Отличия по полу

	n	Ме	РИ	90% ДИ
Женский	392	2,00	0-42,05	30,00-59,00
Мужской	154	0,00	0-2,00	2,00-4,00

	Нижний предел	Верхний предел
No N	0,00	58,0
90% CI	0,00-0,00	52,00-68,00

24 of 35

Исследование осадка�Цилиндры (0 в мкл)

Гиалиновые (0-0/LPF)

Патологические (0-0/LPF)

25 of 35

Исследование осадка�Кристаллы (0-171,4 в мкл)

	Нижний предел	Верхний предел
No N	0,00	140,40
90% CI	0,00-0,00	90,00-425,00

26 of 35

Исследование осадка

Бактерии (0-54,0/HPF)

Отличия по полу

	n	Ме	РИ	90% ДИ
Женский	392	2,0	0-62,80	46,00-103,00
Мужской	154	1,0	0-4,65	2,00-19,00

	Нижний предел	Верхний предел
No N	0,00	54,00
90% CI	0,00-0,00	41,00-80,00

27 of 35

Исследование осадка

Слизь (0-97,9/мкл)

	Нижний предел	Верхний предел
No N	0,00	97,9
90% CI	0,00-0,00	89,00-114,00

28 of 35

Обсуждение

Tomoji Yuno, Sayoko Kawakami, Kanazawa Universitiy, 2015

	Dirui		Sysmex 1000i
	Жен.	Муж.	Жен.	Муж.
Эритроциты, в мкл	0-4,2		~22,7	~13,6
Лейкоциты, в мкл	0-13,6		~16,9	~13,2
Плоский эпителий, в мкл	0-72,9	0,0-2,0	~39,6	~5,2
Переходный эпителий, в мкл	0-2,0		-
Гиалиновые цилиндры, в мкл	0,0-0,0		~0,56	~0,40
Кристаллы, в мкл	0,0-171,4		-
Бактерии, в мкл	0,0-121,9	0,0-2,0	~130,7	~26,4
Слизь, в мкл	0,0-166,0		-

29 of 35

Корреляционный анализ

Показатель	Характеристика корреляционной связи, коэффициент ранговой корреляции Спирмена
Показатель	ρ	Теснота связи по шкале Чеддока	p
V Эритроциты – до Эритроциты	0,878	Высокая	< 0,001*
V Лейкоциты – до Лейкоциты	0,861	Высокая	< 0,001*
V Плоский эпит. – до Плоский эпит.	0,872	Высокая	< 0,001*
V Переходный эпит. – до Переходный эпит.	0,392	Умеренная	< 0,001*
V Бактерии – до Бактерии	0,939	Весьма высокая	< 0,001*
V Кристаллы – до Кристаллы	0,725	Высокая	< 0,001*
V Слизь – до Слизь	0,983	Весьма высокая	< 0,001*

1 of 35

2 of 35

3 of 35

4 of 35

5 of 35

6 of 35

7 of 35

8 of 35

9 of 35

10 of 35

11 of 35

12 of 35

13 of 35

14 of 35

15 of 35

16 of 35

17 of 35

18 of 35

19 of 35

20 of 35

21 of 35

22 of 35

23 of 35

24 of 35

25 of 35

26 of 35

27 of 35

28 of 35

29 of 35

30 of 35

31 of 35

32 of 35

33 of 35

34 of 35

35 of 35