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Spettroscopia Raman

Raman: fotoni Stokes (Antistokes) diffusi anelasticamente:

ω_S=ω₀-ω_vib

ω_AS=ω₀+ω_vib

Raman stimolato: presenza di fotoni Stokes

🡪 aumento della sezione d’urto

🡪direzionalità

La spettroscopia Raman è una tecnica di analisi ampiamente usata in vari campi

per rilevare la struttura vibrazionale del sistema di interesse. Il grande numero di

bande vibrazionali risolte fornisce in un unico spettro moltissime informazioni

strutturali sul campione. Questa tecnica, nella sua implementazione pump-probe,

è inoltre molto sensibile a modifiche della struttura molecolare risolte in tempo.

Nel Raman spontaneo un fascio laser a frequenza wP illumina il campione e i

fotoni diffusi sono quindi dispersi in frequenza e opportunamente rilevati. In

questo caso i fotoni Stokes wS e anti-Stokes wAS vengono generati nel campo di

radiazione di punto zero. La riga Stokes (anti-Stokes) è il risultato dello scattering

anelastico della radiazione incidente, per cui la luce diffusa è spostata verso

frequenze minori (maggiori) di una quantità pari alla frequenza della vibrazione

molecolare nel campione wV .

Il processo di scattering Raman stimolato si verifica quando due fasci di luce, la

pompa Raman a frequenza wP e lo Stokes probe a frequenza wS, vanno ad incidere

sul campione la cui frequenza vibrazionale wn è pari alla differenza wP −wS. In

questo caso l’emissione da parte del campione di fotoni a frequenza wS è stimolata

dalla presenza del campo di frequenza wS del probe, si ottengono quindi fotoni

emessi collinearmente al probe. Questo permette di migliorare notevolmente il rapporto segnale-rumore, tramite l’uso opportuno di una fenditura.

Per cui è posssibile migliorare il rapporto segnale rumore scegliendo la direzione opportuna di acquisizione

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Resonance Raman (RR)

Se l’energia di eccitazione si avvicina a quella di una transizione elettronica R il termine (ν_r_R− ν ₀ − ν_k)⁻¹domina sugli altri 🡪 aumento della sezione d’urto
L’intensità dei modi Raman della specie molecolare associata a quella particolare transizione viene in questo caso notevolmente aumentata, da 10³a 10⁶ ordini di grandezza

🡪Utilità nello studio di macromolecole biologiche

In cui Ms (r) è il momento di dipolo della transizione elettronica espresso in

termini di un sistema di riferimento fermo rispetto alla molecola. Gli indici

maiuscoli e minuscoli, come R e r , si riferiscono rispettivamente agli stati elettronici

e vibrazionali della molecola. GR è la costante di smorzamento associata

al tempo di vita dello stato vibronico di frequenza nrR. Le frequenze n0 e nk sono

rispettivamente la frequenza della radiazione incidente e la frequenza del modo

normale Qk.

La transizione tra lo stato iniziale e finale avviene secondo nG→Rr e Rr →Gm.

La somma su rR indica che per ottenere il tensore di scattering, e quindi l’intensità

Raman, bisogna tenere in considerazione le probabilità di transizione che coinvolgono

tutti gli stati vibronici, anche nel caso in cui lo stato iniziale e finale sono

rispettivamente lo stato vibrazionale fondamentale e il primo stato vibrazionale

eccitato dello stato fondamentale elettronico.

Quando l’energia di eccitazione n0 si avvicina a quella di una transizione elettronica

R, per questa specifica transizione il termine (nrR −n0 −nk)−1 domina sugli

altri nella somma dell’equazione

L’intensità dei modi Raman della

specie molecolare associata a quella particolare transizione viene in questo caso

notevolmente aumentata, da 103 a 106 ordini di grandezza. Quindi la spettroscopia

RR permette di concentrare l’attenzione su alcuni modi ben precisi, e ciò è

molto utile quando si ha a che fare con molecole con un numero elevato di modi

vibrazionali, come per esempio nel caso di macromolecole biologiche.

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Raman pump-probe e limite di Fourier

Impulsi 🡪larghezza spettrale

Linea di ritardo

probe

pump

CCD

monocromatore

campione

15 cm^-1 🡪 1ps

Limite di Fourier:

Pump-probe per lo studio di:

strutture transienti
reazioni chimiche
dinamiche ultraveloci fotoindotte

e cambi conformazionali in sistemi molecolari

In ambiti disciplinari quali la biofisica e la fotochimica, di particolare interesse è lo

studio delle modificazioni di strutture molecolari durante reazioni veloci.

Lo schema tipico per l’indagine di fenomeni ultraveloci utilizza la tecnica di misura

pump-probe. In questa procedura si investe il campione da analizzare con

impulsi pump, innescando così una trasformazione nel campione stesso. Dopo un

intervallo di tempo regolabile, il campione viene investito da un secondo impulso

“sonda” (probe): questo consente di effettuare misure che ne rilevano le proprietà

di interesse. Monitorando l’impulso di probe in funzione del ritardo temporale, si

ottengono informazioni sul processo innescato dal pump con una risoluzione temporale

fondamentalmente limitata solo dalla durata degli impulsi.

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Raman pump-probe e limite di Fourier

Spettro del fruttosio

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RR su emoproteine

His

CO (NO, O₂)

PUMP

PROBE

Una delle linee di attività del laboratorio [4], infatti, riguarda l’applicazione

della tecnica FSRS allo studio delle emoproteine. Poiché il segnale Raman è in

questi sistemi relativamente debole, è conveniente utilizzare lunghezze d’onda

in vicinanza delle bande di assorbimento associate alle transizioni elettroniche,

per sfruttare l’aumento della sezione d’urto dei modi vibrazionali d’interesse in

condizioni di risonanza.

Spettro di assorbimento mostrato in alto a dx

Le emoproteine sono proteine che contengono l’eme, un cromoforo 6 costituito

da un atomo di ferro coordinato con i 4 atomi di azoto di una porfirina, come

illustrato nella figura 1.7.

Il ferro nell’eme può essere coordinato con uno (5-coordinato) o due ligandi (6-

coordinato), che possono essere aminoacidi o molecole esterne, come l’ossigeno

molecolare O2 e il monossido di carbonio CO.

I processi funzionali in molte emoproteine coinvolgono la formazione e la

distruzione dei legami dei ligandi, o lo scambio di ligandi esterni e interni. Quindi

è di particolare interesse studiare la dinamica ultraveloce di questi processi dopo

la fotolisi, ovvero dopo la dissociazione dei ligandi in seguito ad un impulso di

luce di lunghezza d’onda opportuna.

A questo scopo generalmente si fotolizza la proteina in corrispondenza delle bande

di assorbimento elettronico nella regione tra i 500nm e i 600nm, dette bande Q, e si

studiano i modi vibrazionali associati alla banda di assorbimento Soret, il cui picco

si trova tipicamente nel range 350−450nm. Questi modi danno informazioni sullo

stato di coordinazione, di spin e di ossidazione del ferro, sui costituenti periferici

dell’eme e sui legami dei ligandi.

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Il FixL

deoxy FixL: 5-coordinato

oxy FixL:

6-coordinato

His

Kruglik et al. (2007)

Inserire cfr CW

Come esempio di possibile applicazione della tecnica FSRS alle emoproteine

sfruttando la pompa Raman realizzata, vediamo il caso emblematico del FixL, il

cui spettro di assorbimento elettronico nelle forme oxy e deoxy è mostrato in fig.

1.8[10]. Nella forma oxy il ferro è 6-coordinato, e la sesta posizione è occupata

da una molecola di ossigeno, mentre nella forma deoxy il ferro è 5-coordinato. Il

FixL è un sensore dell’ossigeno.

La spettroscopia ps−TR3 è stata utilizzata per caratterizzare la configurazione dell’eme del fotoprodotto primario.

Per studiare in dettaglio la struttura del fotoprodotto, è stata analizzata la

regione delle basse frequenze ed in particolare il range 200-250 cm−1 (fig.1.10),

nel quale ci si aspetta di vedere la banda relativa al legame ferro-istidina (Fe-His)

nel caso di eme 5-coordinato, la cui struttura è detta domed ad indicare il fatto che

il ferro è spostato rispetto al piano della porfirina.

Nello spettro della forma deoxy (i), la banda intensa del legame Fe-His a 217cm−1

è la caratteristica principale sotto i 600 cm−1.

La presenza di questa banda è evidente negli spettri del fotoprodotto CO (f,g,k);

Al contrario, già dopo 0.5 ps, gli spettri (b) del fotoprodotto del complesso oxy

non presentano alcuna evidenza della presenza della banda Fe-His. Questi studi

suggeriscono che la struttura dell’eme del fotoprodotto a 0.5ps non è domed nel

caso dell’oxy-FixLfatto che fa ipotizzare che la molecola di ossigeno si ricombina

nella scala di tempo dei femtosecondi.

Quindi è necessario l’uso di una spettroscopia vibrazionale risolta in tempo che

possa aggirare il limite di Fourier per poter indagare le dinamiche della proteina

su scale dell’ordine dei femtosecondi.

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FSRS: aggiramento del limite di Fourier

Tecnica di elezione per affrontare questo tipo di problemi: FSRS

Nella tecnica FSRS, Femtosecond Stimulated Raman Spectroscopy, si introduce

un terzo fascio di probe, un continuum di durata dell’ordine dei femtosecondi

e di banda sufficientemente larga da poter agire come campo Stokes per l’acquisizione

dell’intero spettro vibrazionale del campione, ottenuto mediante scattering

stimolato.

Come nel ps−TR3 un impulso ultrabreve, la pompa attinica, dà inizio al processo

fotochimico di interesse, ma nella tecnica FSRS l’evoluzione del sistema è studiata,

dopo un ritardo DT, dai due impulsi di probe che sono responsabili dello scattering

Raman stimolato: la pompa Raman (impulso 2 in fig. 1.3 e fig.1.2) e il continuum

(impulso 3 in fig1.3 e fig.1.2).

In questo modo la risoluzione nel dominio delle frequenze è determinata

principalmente dalla larghezza di banda del fascio di pompa Raman,oltre che,

ovviamente, dallo spettrometro utilizzato, mentre la risoluzione temporale dipende

dal ritardo tra il fascio di pump,la pompa attinica, e il continuum.

Le transizioni Stokes del campione provocano un trasferimento efficiente di fotoni

dalla pompa Raman al probe, per cui lo spettro Raman viene determinato dal

guadagno netto dell’impulso probe, ovvero dal rapporto tra il probe in presenza

della pompa e il probe in assenza della pompa

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FSRS

Spettro FSRS del cicloesano

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Estensione FSRS alle proteine: requisiti

Tunabilità 350-500nm
Banda “stretta” <20cm^-1
Energia ~µJ

Amplificatore ottico parametrico in due stadi (OPA)
Compressione spettrale (SHG)

Strategia

Partendo da impulsi (laser Ti:Sa):

λ centrale 800nm
Δν~500cm^-1 🡪Δt~40fs

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Amplificazione parametrica �e SHG

Conservazione dell’energia e del momento

SHG

AMPLIFICAZIONE PARAMETRICA

CRISTALLI BIRIFRANGENTI

Generazione di frequenza differenza nel caso in cui il fascio a freq maggiore (pompa) è molto più intenso di quello a frequenza minore che si vuole amplificare (segnale):

Fotone pompa si suddivide in due: uno con freq segnale + idler con idler=pompa-segnale (conservazione energia)

Si deve conservare anche il momento, e dato che k=n omega…questo porta alla condizione:….

Dato che nei materiali ordinari n monotona crescente in omega, relazione non soddisfatta per materiali isotropi

In tutti i materiali ordinari si verifica una variazione dell’indice di rifrazione (detta

dispersione normale ) in dipendenza dalla frequenza che, nell’intervallo spettrale

dall’ultravioletto al vicino infrarosso, risulta essere monotòna crescente all’aumentare

della frequenza. Riprendendo la prima equazione del sistema (2.43) e

tenendo conto che, secondo l’ipotesi iniziale,w1 <w2 <w3 risulta: n1 < n2 < n3.

Osservando la relazione necessaria per ottenere il phase matching deve risultare

che w3n3 = w1n1 +w2n2 da cui segue che w1n3 +w2n3 = w1n1 +w2n2 ed anche

w1(n3 −n1) = w2(n2 −n3). Quest’ultima relazione è impossibile da verificare in

un materiale isotropo in quanto i valori in parentesi sono uno positivo ed uno negativo.

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Primo stadio

0,5-1 µJ

650-1020nm

1,6mJ

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Secondo stadio

Output:

20-30 µJ

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Compressione spettrale

2ν0

ν0

~tutte le frequenze dello spettro della fondamentale partecipano al processo

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Performance: tunabilità

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Larghezza di banda ed energia

2-3µJ

Larghezze ≤15 cm^-1

6 cm^-1

11 cm^-1

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Conclusioni: confronto con altre tecniche

Tecniche lineari:

Filtro passabanda
Reticolo

Tecniche non lineari:

Di impulsi con chirp

Rendimento energetico ≈ riduzione di banda

Laimgruber et al. (2006)

Rendimento energetico 10%--- energia 14 µJ

compressione spettrale da 2,3nm🡪0,17nm

Sistema realizzato:

Energie ~µJ
Δλ~0,2nm partendo da ~30nm (impulsi più corti)
Primo esempio di tunabilità nel range ~330-500nm

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Phase matching

BBO uniassico negativo n_e<n_o

Polarizzazione del fascio di pompa lungo direzione straordinaria

Tipo I os+oi🡪 ep

Tipo II : os+ei🡪 ep

es+oi🡪ep

Cristalli birifrangenti:

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Differenze tra phase matching di tipo I e II

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Walk off

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Rodopsina

Studio fasi iniziali processo visione
Reazione di fotoisomerizzazione: rodopsina 🡪 batorodopsina

Un esempio di applicazione della tecnica FSRS per osservare dinamiche che

avvengono su scale temporali inferiori al picosecondo è lo studio delle fasi iniziali

del processo della visione.

La vista è il risultato della conversione della energia luminosa in impulso elettrochimico.

L’impulso è trasmesso attraverso i neuroni al cervello, dove i segnali

rivelati da tutti i recettori sono interpretati. Tale recettore è un pigmento chiamato

rodopsina, collocato nella retina. Il pigmento è composto da una molecola organica,

il retinale, associato ad una proteina, l’opsina. Il primo step nel processo della

vista coinvolge la reazione di isomerizzazione4 cis-trans del retinale 11-cis che è

il cromoforo, ovvero la sede dell’assorbimento ottico nella catena proteica della

rodopsina. La produzione del transiente fotorodopsina è una delle reazioni fotochimiche

più veloci in natura e avviene su una scala temporale dell’ordine dei 200

fs (fig.1.4). Conseguentemente, la reazione è estremamente efficiente, avendo un’

efficienza quantica del 65% . Circa il 60% dell’energia incidente è accumulata nel

primo stato termodinamicamente stabile (retinale all-trans) chiamato batorodopsina.

Questa energia è utilizzata per indurre un cambiamento conformazionale nella proteina accoppiata al cromoforo che porterà attraverso una serie di meccanismi

alla sensazione della vista. La tecnica di FSRS rappresenta un potente strumento

in grado di registrare i vari stadi del processo che porta dalla rodopsina alla

batorodopsina [3].

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