Modul 11

​

Ekstraktion af miljø-DNA fra filter

​

​

(Tager min. 2 timer, da der er en pause på 60 min)

​

​

Formål med ekstraktion af miljø-DNA

I skal lære

• at ekstrahere miljø-DNA fra et sterivex-filter
• navne på redskaber og væsker
• at følge alle detaljer i øvelsesvejledningen

Program

​

• Gruppeinddeling
• Hvor er alle materialer?
• To grupper åbner af sterivex-filter
• Alle grupper Ekstraherer miljø-DNA fra sterivex-filter
• Oprydning
• Opsamling

​

​

Materialer

Materiale til deling

• Affaldsstativer 4
• Vortexer 2
• Bordcentrifuge 2
• En kasse med 1,5 ml-eppendorfrør
• Farvet eppendorfrør/blå
• Sprøjteflaske med 5% klor x4
• Sprøjteflaske med 70% sprit x4
• Handsker
• Køkkenrulle
• Kitler x 31
• Inkubator/varmeskab
• Affaldsdunk med sort låg
• Kasser til opbevaring af udstyr og materialer

​

Materiale til hver gruppe

• Pipetter (p10, p200 og evt. p1000) og tilhørende pipettespidser
• Fine marker tuscher
• Racks til eppendorfrør
• DNA-oprensningssøjle
• Opsamlingsrør (Collection Tube)
• DNA-rør (1,5 ml LoBind-rør)
• Blå 1,5 ml eppendorf-rør
• 0,5 ml mikrorør
• Protokoller

​

Væsker til grupperne

• Lyseringsbuffer
• Proteinkinase K
• Bindingsbuffer
• Elueringsbuffer
• Vaskebuffer

​

Åbning af sterivex-filter

Materiale til de to grupper:

• et Sterivex-filter pr. gruppe
• en plastbakke pr. gruppe
• en petriskål pr. gruppe
• en pincet pr. gruppe
• en saks pr. gruppe
• en skalpel pr. gruppe
• en rørtang til deling
• 4 eppendorfrør af 1,5 ml
• et stativ til eppendorfrør

​

Åbning af sterivex-filter

Dette trin udføres af to grupper

Alle grupper modtager nu filter og prøvenummer

​

4 grupper modtager filter og prøvenummer fra gruppe 1

​

4 grupper modtager filter og prøvenummer fra gruppe 2

Lysering - alle grupper fra nu af

​

• Lyseringsbuffer
• Nedbryder cellerne i filterpapiret
• Proteinase K:
• Proteiner, som kan ødelægge DNA, nedbrydes.
• Varmeskab - 60 min.
• DNA udtrækkes fra filteret og kommer ud i væsken

​

60 min - anden aktivitet

Binding af DNA i oprensningssøjle

​

• Bindingsbuffer
• faciliterer binding af DNA på membranen i oprensningssøjlen
• Oprensningssøjle
• Opsamlingsrør

​

Vaske membran - 2 gange

• Vaskebuffer
• Faciliterer udvaskning af andre molekyler end miljø-DNA fra membranen fra oprensningssøjlen ned i opsamlingsrøret

​

Eluer/frigør miljø-DNA fra membranen

• Elueringsbuffer
• Miljø-DNA slipper nu membranen i oprensningssøjlen og kommer ud i væsken i det blå eppendorfrør

Del-ekstraktioner samles

4 grupper med prøvenummer 1 overfører væske til DNA-rør 1

4 grupper med prøvenummer 2 overfører væske til DNA-rør 2

​

Begge DNA-rør afleveres til læreren og kommer i fryseren.

​

Oprydning

​

​

• Ryd op på bordet
• Placer materiale på rullebord
• Rengør bordet med 70% ethanol
• Placer kittlerne på deres pladser

​

​

Opsamling

• Hvor mange navne på redskaber og væsker kan I huske med jeres makker?
• Hvilke dele i øvelsesvejledningen har været udfordrende?
• Hvordan har I overordnet set fået ekstraheret eDNA fra et filter over til et eppendorfrør?