Інноваційні методи лабораторної діагностики емерджентних �хвороб тварин

доктор ветеринарних наук, �професор, член-кор. НААН �А.П. ГЕРІЛОВИЧ

​

ГО “Інститут Єдиного Здоров'я”

Державний НДІ з лабораторної діагностики �та ветсанекспертизи

Емерджентні інфекції людини та тварин

• 1997 – високопатогенний грип птиці H5N1
• 2002-2003 – SARS
• 2007 – африканська чума свиней
• 2009 – “свинячий грип” H1N1
• 2014 – Ебола
• 2015 – вірус Зіка
• 2020 – SARS CoVi2

2

3

Пандемія COVID-19

• Тяжкий гострий респіраторний синдром, ТГРС або атипову пневмонію (SARS-CoV, епідемія в Азії 2002–2003 рр., 8 096 захворілих, 774 загиблих) (National Health Service (England), 2019),
• Близькосхідний коронавірусний респіраторний синдром, БКРС (MERS-CoV, спалахи в Азії 2012–2015 рр., 2 538 захворілих, 871 загиблих) (WHO, 2020)
• Нова коронавірусна інфекція — COVID-19 (SARS-CoV-2, пандемія якої розпочалася наприкінці 2019 р.

• Методи прямого виявлення збудника:

А) за детектуванням генетичного матеріалу

Б) за виявленням антигенів збудника

В) вірусоскопічні методи

• Методи серологічної діагностики
• Методи виявлення інфекції за реакцією організму-хазяїна

4

Інноваційні методи діагностики

5

На сьогодні поряд з традиційними діагностичними тестами в гуманній та ветеринарній медицині дедалі ширшої популярності та значимості набувають такі молекулярно-генетичні методи діагностики, як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), полімеразна ланцюгова реакція в режимі реального часу (ПЛР-РЧ, Real-time PCR) рестрикційно-ензимний аналіз, електрофорез у пульсуючому полі, секвенування специфічних ділянок геному, секвенування нового покоління (NGS) тощо

Методи молекулярної діагностики та молекулярної епізоотології (епідеміології)

• Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

​

• Секвенування �ДНК патогенів

​

• Рестрикційне картування�з метою визначення �генотипу та патотипу збудників

​

​

• Гібридизаційні

методи

​

• Плазмідне картування та ін.

6

7

• надзвичайно висока чутливість методу (визначення РНК і ДНК збудників у біологічному та патологічному матеріалі при наявності 200-1000 бактеріальних клітин або віріонів у пробі)
• експресність (тривалість аналізу 6-12 годин)
• можливість проведення групових досліджень
• висока специфічність �(від 95 до 100 %)

​

ПЕРЕВАГИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИХ МЕТОДІВ ДІАГНОСТИКИ ІНФЕКЦІЙНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ ТВАРИН

8

• відносно висока собівартість досліджень (300+ грн. за аналіз на одну інфекцію)
• необхідність кваліфікованого відбору досліджуваних зразків
• потреба у коштовному спецобладнанні та кваліфікованому персоналі
• високі ризики контамінації ДНК-продуктами та, як наслідок, отримання хибно-позитивних результатів
• чутливість методів до умов проведення випробувань

​

ДЕЯКІ НЕДОЛІКИ МОЛЕКУЛЯРНО-

ГЕНЕТИЧНИХ МЕТОДІВ ДІАГНОСТИКИ ІНФЕКЦІЙНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ ТВАРИН

​

Найбільш важливі напрями застосування �молекулярно-генетичних тестів �у ветеринарній медицині

9

У галузі ветеринарної медицини молекулярно-генетичні тести застосовуються з метою:

• моніторингу та діагностики інфекційних та інвазійних захворювань
• типування та паспортизації патогенів тварин, вивчення їх еко-географічних особливостей, дрейфу генетичної мінливості та еволюції
• дослідження молекулярних механізмів імунної відповіді та взаємодії збудника з макроорганізмом
• контролю якості та безпечності сільськогосподарської продукції, у тому числі продуктів харчування та ГМ-кормів
• контролю якості та безпечності генетичних ресурсів тварин
• контролю циркуляції патогенів у об’єктах довкілля

Свідченням ефективності та доцільності застосування молекулярно-генетичних тестів є темпи зростання обсягів їх впровадження у світі. Лише за останні 10 років фінансові видатки на розвиток цих біотехнологій виросли з 2 до 140 млрд. доларів США на рік

Міжнародні програми наукових досліджень щодо розробки засобів молекулярної діагностики

Розробка та впровадження молекулярно-генетичних методів діагностики на сьогодні є пріоритетним вектором для більшості міжнародних програм підтримки наукових грантів у галузі біологічної безпеки, зокрема:

• Horizon Europe (Євросоюз)
• Програми Групи Семи “Глобальне партнерство” (G7)
• Програми спільних біологічних досліджень �(Держдепартамент США)
• Програми зменшення біологічної загрози �(Міноборони США)
• Програми нерозповсюдження (Велика Британія)
• Німецька програма з біобезпеки (ФРН)

Сумарний фонд фінансування для України за цими програмами складає 3-5 млрд. доларів США на рік

​

10

11

• Мануал МЕБ з діагностичних тестів і вакцин для наземних тварин
• Кодекс здоров’я наземних тварин МЕБ
• Програма Глобального контролю інфекційних хвороб Всесвітньої організації охорони здоров’я (Global Health Security Agenda)
• Інструктивні документи щодо моніторингу інфекційних хвороб тварин і контролю безпечності сільськогосподарської продукції Продовольчої та сільськогосподарської організації ООН (ФАО)
• Директиви Євросоюзу з контролю емерджентних і зоонозних інфекцій (африканської чуми свиней, сибірки, бруцельозу, ящуру, блютангу, хвороби Шмалленберг тощо) та оцінки біологічних ризиків

Міжнародна нормативно-правова база щодо використання молекулярно-генетичних методів у ветеринарній медицині

Методи детектування генетичного матеріалу збудника

• Полімеразна ланцюгова реакція – метод, заснований на ампліфікації (примноженні кількості) копій ДНК-послідовностей-аналітів за допомогою олігонуклеотидних праймерів (затравок, стартерів реакції), індукованій ферментом Taq-полімеразою

12

Різновиди ПЛР

• Класична ПЛР
• Реверсивно-транскриптазна ПЛР (у тч one-step)
• Nested-ПЛР
• Мультиплексна�ПЛР

13

Вітчизняні діагностичні тест-системи� на основі методу ПЛР:�

• Тест-система для виявлення провірусної ДНК вірусу лейкозу ВРХ
• Тест-система для виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н5N1 методом полімеразної ланцюгової реакції
• Тест-система для виявлення РНК вірусу ньюкаслської хвороби методом ПЛР «Poul-RNA-test-NDV»
• Тест-система для виявлення ДНК вірусу інфекційного ринотрахеїту ВРХ «Bovi-DNA-test-IRT»
• Тест-система для виявлення ДНК вірусу хвороби Ауєскі «Sui-DNA-test – ADV»
• Тест-система для виявлення ДНК цирковірусу свиней «Sui-DNA-test-PCV2»
• Тест-система для виявлення РНК вірусу діареї ВРХ «Bovi-RNA-test-BVDV»,

а також ПЛР-тест-системи для виявлення вірусу лейкозу, мікоплазм, хламідій, вірусу репродуктивно-респіраторного синдрому, парво- та цирковірусу свиней методом ПЛР у режимі реального часу

​

14

Методи детектування генетичного матеріалу збудника

• Полімеразна ланцюгова реакція у режимі реального часу – метод, заснований на ампліфікації (примноженні кількості) копій ДНК-послідовностей-аналітів за допомогою олігонуклеотидних праймерів (затравок, стартерів реакції), індукованій ферментом Taq-полімеразою. Інтенсивність утворення копій обліковується автоматично завдяки утворюваному флуоресцентному сигналу зондів, компліментарних матриці-аналіту

15

Різновиди полімеразної ланцюгової реакції у режимі реального часу

• Якісна
• Мультиплексна
• Кількісна
• Платформи: �а) Інтеркалюючі �барвники, �б) TaqMan зонди

16

17

Полімеразна ланцюгова реакція у режимі реального часу: переваги і недоліки

• Переваги:
• Висока чутливість та специфічність
• Нижчий за класичну ПЛР ризик контамінації
• Швидка та низькопрацемістка
• Підходить для кількісного аналізу
• Підходить для використання в мультиплекс форматі
• Недоліки
• Потребує коштовного обладнання
• Для дизайну зондів потрібно чітко знати послідоність таргетних ділянок ампліфікації
• Артефактний сигнал при використанні інтеркалюючих барвників
• Чутлива до дії інгібіторів

18

Вітчизняні діагностичні тест-системи � на основі ПЛР в режимі реального часу:�

• Тест-система для виявлення ДНК вірусу АЧС
• Тест-система для виявлення ДНК капріпоксвірусів
• Тест-система для виявлення ДНК збудника сибірки (B. anthracis) та ідентифікації капсуло/спороутворюючих варіантів збудника
• Тест-система для виявлення ДНК збудника туляремії
• Тест-система для виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н5N1 Тест-система для виявлення РНК вірусу ньюкаслської хвороби методом ПЛР «Poul-RNA-test-NDV»

19

Інші ампліфікаційні методи детектування генетичного матеріалу збудника

• Транскрипційні ампліфікаційні методи:
• Ампліфікація, заснована на нуклеотидній послідовності нуклеїнової кислоти (NASBA) та транскриптазо-індукована ампліфікація (ТМА) – методи, засновані на ампліфікації (примноженні кількості) копій РНК-послідовностей, транскрибованих з кДНК-матриць-аналітів за допомогою зворотної транскриптази, Н-РНКази (у NASBA) та Т7-РНК-полімерази з визначенням отриманих продуктів методами РЧ-ПЛР або гель-електрофорезу.

20

NASBA

21

NASBA/TAM: переваги і недоліки

• Переваги:
• Належна чутливість та специфічність
• Швидко виконуться (швидша за ПЛР)
• Можливість мультиплексного застосування
• Підходить для кількісного аналізу та генотипування
• Проходить в умовах 41 С
• Недоліки
• Зберігання та підготовка РНК критично важливі
• Використовуються високовартісні ферменти, які є термолабільними
• Низька температура проведення реакції зумовлює ризики неспецифічних реакцій

22

Ізотермальна ампліфікація

• Петльова ізотермічна ампліфікація (Loop mediated isothermal amplification, LAMP) – це метод ампліфікації ДНК в одній пробірці. LAMP дозволяє проводити молекулярну діагностику істотно швидше і дешевше порівняно з ПЛР. Для детекції РНК-вірусів LAMP можна поєднувати з етапом зворотної транскрипції.
• LAMP – ізотермічний метод ампліфікації нуклеїнових кислот. На відміну від ПЛР він не вимагає постійної зміни температурних циклів, реакція протікає при постійній температурі, що забезпечує високу ефективність ампліфікації (ДНК ампліфікується 10⁹-10¹⁰ разів за 15-60 хвилин). Незмінна температура також дозволяє уникнути необхідності використання ампліфікаторів.

​

23

LAMP: переваги і недоліки

• Переваги:
• Належна чутливість та специфічність
• Простота виконання та швидкість
• Не потребує особливого обладнання
• Не чутлива до інгібіторів
• Підходить для генотипування та кількісного аналізу
• Недоліки
• Потребує 6 праймерів в реакції
• Високий ризик контамінації
• Візуальна детекція може носити суб'єктивний характер
• Не придатна для дизайну мультиплексних методів

24

Основні інноваційні розробки�ННЦ “ІЕКВМ” на основі LAMP:�

• Методики виявлення ДНК:

ЦВС-2

вірусу АЧС

патогенних лептоспір

25

• Аналіз плазмідних профілів
• Простий рестрикційний аналіз з гель-електрофорезом
• Електрофорез в пульсуючому полі
• ПДФР-аналіз (аналіз поліморфізму довжин фрагментів ректрикції): фінгерпринтинг та риботипування
• Гібридизаційні методи

​

26

Неампліфікаційні методи молекулярної діагностики інфекційних хвороб тварин

Гібридизаційні методи:

• In-situ гібридизація
• FISH
• GISH
• ДНК-чіпи

​

27

Неампліфікаційні методи молекулярної діагностики інфекційних хвороб тварин

28

Метод ДНК(РНК)-чіпів

В основі роботи ДНК-мікрочіпів лежить явище гібридизації. При наявності невеликих кількостей ДНК досліджуваного зразка здійснюють ампліфікацію. Для аналізу РНК спочатку проводиться зворотна транскрипція, що втім не обов'язково: існують чіпи, які працюють як з ДНК, так і з РНК. Перевірка зразків ДНК / РНК полягає в мічення зразків різними флуоресцентними мітками для подальшого виявлення і нанесенні зразків на мікрочип.

Облік аналізу проводиться автоматично через зчитування флуоресцентного сигналу.

• Спейсерне типування (споліготайпінг)
• ПЛР-ПДРФ-аналіз (PCR-RFLP assay)
• Мультилокусне алельне типування
• Секвенування мінливих фрагментів ДНК
• Виготовлення геномних бібліотек та повногеномне секвенування

​

29

Аналітичні ампліфікаційні методи молекулярної діагностики інфекційних хвороб тварин

• Секвенування мінливих фрагментів ДНК - це метод визначення нуклеотидної послідовності попередньо ампліфікованого мінливого фрагменту генетичного матеріалу збудника на основі класичної ПЛР з наступною ампліфікацією з використанням мічених нуклеозидів (термінаторів) та зчитуванням послідовності інструментально методом капілярного електрофорезу.
• Метод запропонований Ф. Сангером �

30

Аналітичні ампліфікаційні методи молекулярної діагностики інфекційних хвороб тварин

Схема секвенування за Сангером Ф.

31

Секвенування нового покоління

• Секвенування нового покоління (англ. Next generation sequencing, NGS) - група методів визначення нуклеотидної послідовності ДНК і РНК.
• Технологія методів секвенування нового покоління дозволяє «прочитати» одноразово відразу кілька ділянок геному, що є головною відмінністю від попередніх методів секвенування.
• NGS здійснюється за допомогою повторюваних циклів подовження ланцюга, індукованого полімеразою, або багаторазового лігіювання олігонуклеотидів. В ході NGS можуть генеруватися нуклеотидні послідовності довжиною кілька мільярдів пар н.з. за один робочий цикл.

32

Порівняння методів NGS

33

33

Публікації щодо досліджень �з використанням NGS

34

Методи виявлення антигенів збудників

• Імуноблотинг

​

• Імуногістохімічні дослідження

​

• Імунохроматографія

​

• Мікрочіпи

35

Методи виявлення антигенів збудників

• Біосенсори - це аналітичні пристрої, які використовуються для виявлення хімічної речовини, що поєднує біологічний компонент з фізико -хімічним детектором. Чутливий біологічний елемент, напр. тканина, мікроорганізми, органели, рецептори клітин, ферменти, антитіла, нуклеїнові кислоти тощо - це біологічно похідний матеріал або біометичний компонент, який взаємодіє з досліджуваним аналітом, зв’язується з ним або розпізнає його. �Біологічно чутливі елементи також можуть бути створені за допомогою біологічної інженерії. Перетворювач або елемент детектора, який перетворює один сигнал в інший, працює фізико-хімічним способом: оптичним, п’єзоелектричним, електрохімічним, електрохемілюмінесцентним тощо, що виникає в результаті взаємодії аналіту з біологічним елементом, для легкого вимірювання та кількісної оцінки. �Пристрій зчитування біосенсорів підключається до пов'язаної з ним електроніки або сигнальних процесорів, які в першу чергу відповідають за відображення результатів зручним для користувача способом. Іноді це є найдорожчою частиною сенсорного пристрою, проте можна створити зручний дисплей, який включає перетворювач і чутливий елемент (голографічний датчик). Зчитувачі зазвичай розробляються на замовлення та виготовляються відповідно до різних принципів роботи біосенсорів.
• Експрес-культивування та автоматичний мікробіологічний аналіз

36

Вірусоскопічні методи

• Світлова мікроскопія (імуногістохімічні та гібридизаційні методи)
• Електронна мікроскопія:�- трансмісійна ЕМ, ТЕМ,�- імуноелектронна мікроскопія, ІЕМ,�- скануюча ЕМ, СЕМ, �- кріоелектронна мікроскопія, КЕМ

37

Розвиток електронної мікроскопії

38

Методи серологічної діагностики

• Імуноферментний аналіз (ІФА, ELISA) – різні модифікації, у тч з використанням рекомбінантних антигенів та моноклональних антитіл для виявлення окремих антигенів та їх епітопів
• Імуногістохімічні дослідження
• Іммуноблотинг
• Імунохроматографічні тести

39

Методи виявлення інфекції за реакцією організму-хазяїна

• Біосенсори, спрямовані на реєстрацію зміни фізичних (рН, електромагнітні поля) та хімічних характеристик в макроорганізмі, притаманних тій чи іншій інфекційній патології

​

• Методи алергічної діагностики

​

• Дихальна проба - це неінвазивний спосіб діагностики ряду клінічних станів. Аналізуючи склад повітря, може бути виміряна кількість певних газів, дозволяючи швидко і точно поставити діагноз.�

40

Дякуємо за увагу!