Desarrollo de técnicas de Cromatografía liquida

Josmelith Cordero Rosario Stella Sanchez León

Especialistas de producto

2020

The life science business of Merck operates as MilliporeSigma in the U.S. and Canada.

Agenda

Desarrollo de técnicas cromatográficas

Factores a tener en Cuenta

1

2

Desarrollo de técnicas cromatograficas

01

Un nuevo desarrollo

Marketing ha investigado y el uso de la mezcla de XX con ZZ en tabletas que permite concentrarse necesitamos que desarrollen la técnica analítica

Para que??,

Por que??,

Como??,

​

Quien?

​

Donde??,

Cuando??

„Objetivo desarrollar el método cromatografico para separar y análizar XX y ZZ; este desarrollo se realizará en una semana“

1. Porque se realiza el desarrollo del método :
1. Un nuevo producto?
2. Que analitos se requieren analizar
1. En que matriz estan los analitos......etc, etc
2. Para que se realiza
• Un desarrollo puntual
• Desarrollo un nuevo producto
• Control de Calidad

3. Como se va a realizar?

Buscar la tecnica y los insumos para el desarrollo, verificar las restricciones que se tienen

4. Quien va a realizar el desarrollo, necesita entrenamiento?

5. Que parámetros va a cumplir : resolución, tiempo de ejecución, número de� muestras para analizar por lote, límites de detección y cuantificación,� linealidad, rango, etc.

6. En que tiempo se requiere terminada

7. Restricciones en el laboratorio, por equipo, por insumos.

CON ESTOS DATOS INICIE EL PROYECTO DE DESARROLLO

​

​

1. Objetivo
2. Revisión Bibliografica
3. Parámetros que se deben cumplir

​

​

​

​

​

​

​

4. Planeación teórica de los diferentes métodos planeados

5. Nueva revisión Bibliografica

6. Resultados

7. Conclusiones y recomendaciones del proyecto

​

​

Desarrollo

Información de la

muestra

Método OK

Métodos

especiales

Liberación de método

Pasos

preparativos

Método alternativo

Columna, fase móvil,

caudal vol.. inyección

Optimización Validación

Condiciones Detector

Método Preliminar

Definición del sistema preliminar

INFORMACION PRIMARIA

Objetivos

no

si

Analito o Analitos

concentracción

Rango lineal

estabilidad

Peso

molecular

espectros

Estructura molecular

Isómeros?

Propiedades que permitirá ser detectado

Constantes físicas

En que es insoluble

En que es soluble

Que atomos tiene

Pka.a

Particiones posibles de la molécula

Matriz

Concentración de cada componente

Rango lineal

estabilidad

Peso

molecular

espectros

componentes

Cuáles compuestos se formaran si se descomponen

Propiedades que permitirá ser detectados

Constantes físicas

En que son insoluble

En que son soluble

componentes

Interferencias posibles

Contaminantes que afecten columna

Encontrar Técnica

Bibliografía excepcional

www.sigmaaldrich.com

www.Merckmillipore.com

Factores a tener en cuenta

O2

Estándares

http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/analytical-standards.html

Nuestra amplia oferta de Materiales de Referencia!

Guías ISO, Normas y Definiciones

Reference Material (RM) (ISO 17034, 17025)

• Certificado para los requisitos que son menos exigentes que para un CRM
• Manufacturados por un productor de Materiales de Referencia acreditado

​

Grado Reactivo/ Investigación Química

• Pueden tener Certificado de análisis
• No están caracterizados para ser usados como materiales

de referencia

Institutos Nacionales Metrología (ej: NIST, NPI, NPL, BAM) ó �Estandares Compendiales (ej: USP, EP, BP, JP, IP etc.)

• Emitido por un organismo autorizado
• Se considera que proporcionan el más alto nivel de exactitud y trazabilidad

Estándar Analítico (ISO 9001)

• Certificado de Análisis disponible
• El nivel de certificación varía

Material de Referencia Certificado (CRM) (ISO 17034, 17025)

• Se considera que proporcionan el más alto nivel de exactitud, incertidumbre, y trazabilidad a una unidad de medida del SI
• Manufacturados por un productor de Materiales de Referencia acreditado

Materiales de Referencia

ISO / IEC 17025

CNAS-CL01

(Norma para laboratorios de análisis y calibración)

ISO Guía 31

(Guía para documentación, certificados)

ISO 17034 / Guía 34

CNAS-CL04

(Norma para productores de materiales de refrencia)

18

Materiales de Referencia

ISO Guía 35

(Guía para homogeneidad y estabilidad)

Guías ISO, Normas y Definiciones

Información Incluida en el CoA

Certificado

Certificado

​

Certificado

Certificado�

Certificado

Certificado

CaracterizaCiÓn POR Balance de Masas

Concepto y Asignación de Contenido

Contenido o�Potencia

Pureza

Cromatográfica

Pureza y sustancias relacionadas

Usar al menos dos técnicas+

Evaluación NMR

Solventes Residuales

GC Headspace�USP<467>

Residual de agua

Karl Fischer USP<921>

Contenido Inorgánico Residual

ROI USP<281>

Evaluación NMR

EA u otro

Estándares farmacéuticos Secundarios

Productos higroscópicos

• Si está siguiendo la farmacopea USP, necesita determinar el contenido de agua por KF al momento de uso del estándar, cuando tenga su valor de corrección aplicarlo al peso gravimétrico. Al pesarlo se debe usar como está (no secarlo), y luego calcule con el valor de base anhidra.

• Si está siguiendo la farmacopea EP, puede manejar el estándar tal cual y usar el valor de refencia as is basis

PT (Inter-laboratorios)

Proceso

Proficiency Testing

Columnas

Técnica Pharmacopeica para XX y ZZ

Técnica USP para XX y ZZ

La columna recomendada para la técnica es സംയോജിത വോളിയം Columna

Técnica Pharmacopeica para XX y ZZ

La columna recomendada para la técnica es സംയോജിത വോളിയം Columna

സംയോജിത വോളിയം

L1

150 mm

4,6 mm

1,5 a 10 um

Si

No

Si

No

No

Si

​

r

En el fondo, muy en el fondo no todas las columnas son iguales

¿Será igual la interacción de mi analito con la base de la columna?

H-ö-iS

Si-ö-H

Si-ö-H

Si-ö-H

Si-ö-H

Si-ö-H

Si-ö-H

Si-ö-H

Si-ö-H

Si-ö-H

Si-ö-H

H-ö-iS

H-ö-iS

H-ö-iS

H-ö-iS

H-ö-iS

¿La interacción de una molécula es la misma si la columna tiene base Silanolica o polimérica??

¿Y si mi columna es C18, afectará?

La columna con mayor cubrimiento es del 32%

Bases de columnas

​

​

Fused-Core^®

Particulas de silica con poros superficiales (SPP)

�

​

Particulas de silica porosa(FPP)

​

Silica Monolitica

Pariculas polimericas porosas

​

• Gran estabilidad al pH (pH 0-14)

​

• Discovery^® /Ascentis^®
• Purospher^® STAR / SeQuant^®
• Titan^®

• Escalable de micro a Preparativa
• Buena capacidad de carga

• Ascentis Express^®
• BIOshell^®

• Escala Análitica Micro /UHPLC / HPLC
• Alta eficiencia

• Chromolith^®
• Chromolith^® WP

• Escalable Micro-LC- preparativa

Matriz de tolerancia excepcional / vida útil

• SeQuant^® ZIC^® pHILIC
• apHera

Entonces la base es muy importante

A o B

% de Recubrimiento de la Fase Estacionaria�

7% C18:

​

5% C18:

​

10% C18:

​

Tamaño de poro

Reactivos

Analisis Instrumental

Análisis Clásico y síntesis

Cromatografía Líquida - HPLC

Producto desarrollado para uso específico de Cromatografía de Líquidos.

​

​

• Consistencia Lote a Lote

​

• Solventes previamente Filtrado por 0.2 μm

​

• Solvente de Grado Gradiente o Isocrático

​

• Cumple con ACS y Ph Eur

​

​

Filtración de Fases Móviles

Cromatografía Líquida – HPLC

​

Solventes previamente Filtrado por 0.2 um

​

Dos calidades

Especificaciones de producto y ventajas LC-MS

​

Solventes y mezclas de solventes LiChrosolv^® hypergrade probados para su aplicación en Cromatografía Líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS).

​

La calidad de los solventes proporciona las mejores especificaciones técnicas para asegurar una resolución y sensibilidad superior en las aplicaiones de LC-MS:

​

​

• El mas bajo perfil de impurezas

​

• Ruido minimo en la línea base

​

• El nivel más bajo de background iónico

​

• Reducción en la formación de aductos

​

​

LC-MS

Influencia de la calidad del acetonitrilo en el ruido de fondo en un espectro de masas.

​

Hypergrade

Elimina picos contaminantes

​

• Microfiltración por filtro de 0.2 µm:

​

• Vida útil prolongada de los filtros y piezas mecánicas en el sistema de HPLC.
• Riesgo reducido de taponamiento de columna

​

​

• Empacados en botellas de vidrio borosilicato GL45:

​

• Conveniente para conección directa con el instrumento
• Se reduce el riesgo de contaminación iones metálicos

​

​

• Los niveles mas bajos de impurezas de trazas de metales: para minimizar la formación de aductos de iones metálicos
• Hasta <5ppb

​

​

​

• El nivel más bajo especificado de impurezas de Polietilenglicol(PEG) proporciona confianza en los resultados (PEG S/N relación señal/ruido <50)

único !

Especificaciones y ventajas de producto II�

Diferentes formas de preparación de fase móvil

Manejo de fases móviles

Preparación de una fase móvil : 40% Agua 60% Metanol

​

Existen diferentes formas de prepararle, con diferentes resultados cromatográficos

Preparación de muestra

Extracción

líquido-líquido

Extrelut

.

Micro-extraccíon en fase sólida. SPME

Extracción

en fase sólida. SPE

QuECHerS

​

Filtración

Extracción liquido - liquido

  Extracción

 líquido - líquido

• Separación mediante solventes inmiscibles
• Utilizado en diferentes técnicas analíticas
• Muy conocido

​

Pero

• Se gasta tiempo
• Se consumen solventes
• Se puede formar emulsión

​

​

​

​

.

EXtrelut®

Extracción líquido-liquido

• Separación mediante solventes inmiscibles
• Utilizado en diferentes técnicas analíticas
• Uso de menos solvente
• No se forman emulsiones

1 ml (EXtrelut® NT1)

3 ml (EXtrelut® NT3)

20 ml (EXtrelut® NT20)

​

​

​

​

​

​

.

Extrelut®

57

1. Extrelut^® NT

2. Aplicar la muestra

4. Elución

Sustancias extraídas de la muestra

3. Aplicar solvente organico

(no miscible con agua)

Distribución de la fase acuosa en el Extrelut^® NT

Determinación de medicamentos �antiepilépticos (AEDs) en suero humano

​

Condiciones HPLC:

Columna: LiChroCart^® 250-4 LiChrospher^® RP-select B 5 µm

Fase Móvil: A: Agua / Acetonitrilo (1+1)

B: Agua

Gradiente: Tiempo % A % B

0 min 10 % 90 %

30 min 60 % 40 %

44 min 60 % 40 %

44.1 min 100 % 0 %

50 min 100 % 0 %

51 min 10 % 90 %

75 min 10 % 90 %

Flujo: 1 mL/min

Temperatura: 30 °C

Detección: UV 205 nm

SPME

SPME

Tecnica introducida por Janusz Pawliszyn, Ph.D. Tecnología de la Universidad de Waterloo, Canadá usada inicialmente para la determinación de compuestos clorados en aguas contaminadas

SPME

Micro-Extracción en fase solida

Muestra líquida

o sólida

Muestra líquida

Espacio

de cabeza

Inmersión

directa�

Solventes Residuales en productos farmacéuticos

Residual solvents determination in pharmaceutical productsby GC-HS and GC-MS – SPME Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis18 (1998) 623 – 638

SPE

Preparación de muestras

1. Limpieza analito

Contaminante

Analito

Preparación de muestras

​

2. Concentración del analito

Contaminante

Analito

Fases Estacionarias

SPE para Micotoxinas

SPE para diferentes aplicaciones

SPE

Extracción en fase solida

.

SPE, mejora la técnica

Sin extracción de fase sólida (SPE)�

Después de la limpieza con SPE�

Izquierda: Cromatograma HPLC de una muestra de orina no tratada que contiene un medicamento y metabolitos. �Derecha: misma muestra después de la limpieza con SPE.

Muestra de orina que contiene fármaco y metabolito�

Quick, Easy, Cheap Effective, Rugged, Safe Rápido, Fácil, Económico, Efectivo, Robusto y Seguro

�QuECHERS

SigmaAldrich.com/quechers

Pesar 10 g de muestra homogenizada hidratada adicionar 10 ml de ACN en un tubo de 50 ml. Adicionar ISTD

Adicionar 4g MgS04, 1 g NaCl agitar Vigorosamente por 1 min Centrifugar por 5 minutos a 5000 rpm

Transferir una alícuota de 1ml de sobrenadante a un tubo de microcentrífuga conteniendo 150mg MgSo4 y 50 mg PSA agitar 1 min Centrifugar a 6000 rpm

Trasferir 0,5 ml a un viall para GC o HPLC

Pesar 15 g de muestra homogenizada hidratada adicionar 15 ml de 1% Acido acético en ACN en un tubo de 50 ml. Adicionar ISTD

Pesar 10 g de muestra homogenizada hidratada adicionar 10 ml de ACN en un tubo de 50 ml. Adicionar ISTD

Adicionar 6g MgS04, 1,5 g AcONa agitar Vigorosamente por 1 min Centrifugar por 1 minutos a >1500 rpm

​

Transferir una alícuota de 1ml de sobrenadante a un tubo de limpieza dispersiva conteniendo Mgso4 PSA, (C18, GCB u otros) Agitar 30 seg Centrifugar >1500 rpm

Preserve con tolueno para GC o GC MS Y con 6,7 mM acido fórmico para LC LC/MS

​

Adicionar 4g MgS04, 1 g NaCl, 1 g Na2 citrato.2H2O 0,5 g Na2Hcitr2.5H2O Agitar Vigorosamente por 1 min Centrifuge por 5 minutos a 3000 rpm

​

Transferir una alícuota de 1ml de sobrenadante a un tubo de limpieza dispersiva conteniendo 25 mg PSA y 150mg Mgso4 (2,5 o 7,5 mg de grafito para pigmentos) Agitar 30 seg (5 min usando grafito) Centrifugar 5 min a 3000 U/min

Preserve con 5% acido fórmico y ACN

GC o HPLC MS

Original AOAC EN

Anastassiades and Lehotay 2003 AOAC 2007.01 EN 15662

Qu

E

CHeRS

*Protege analitos sensibles a las bases Mayor recuperación analitos sensibles al pH Evitar el uso de ácido acético ya que hace ineficaz la limpieza con PSA

• Incluye NaCl para limitar interferencias polares Con los cítricos evitar el uso de NaOH

dSPE QuECher

70

PSA Supelclean ™ “Primary Secondary Amine”

Remueve: ácidos grasos, ácidos orgánicos, Pigmentos polares azucares

Supelclean ™ ENVI-Carb ™ Carbón polimerico

Remueve: clorofila y Carotenoides

Discovery® DSC-18

Remueve: lípidos y compuestos no polares

* ENVI-Carb es mencionado en el método EN 15662 como carbon adsorbente!

Remover / atrapar

Interferencia/Matriz

Selección del absorbente dispersante

Quechers

filtración

Micro-Filtracion para HPLC

Ideal

Micro-Filtracion

Real

Factores a considerar en la filtración ….

Que pasó entonces con la membrana de Nylon….

Acetaminophen

Acetyl Salicylic acid

Caffeine

Propiedades fisicoquímicas de las membranas

Todas son membranas de nylon de diferentes marcas, serán iguales?...�� Será igual filtrar con cualquiera de ellas???

Formato de poros - Simetria de Membrana

Asimétrico

Simétrico

Membrana Express Plus^TM

• PES - Polietersulfona

Todas las membranas no son iguales

PVDF

Nylon

PTFE

Membranas son mayoritariamente aire

Existen diferencias claras en sus estructuras

Membranas diferentes con el mismo tamaño de poro pueden diferir en relación a la tasa de flujo

Membranas 0,45

Presión

Sistemas de filtración de 47mm o 90mm

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Extraibles

Compatibilidad Química

La compatibilidad química es uno de los factores decisivos clave para los usuarios finales al elegir una membrana.

Millex®

PTFE hidrofílica

PTFE hidrofóbica

Durapore^® PVDF

PES Express® 

Nylon

LG, LCR

GV, HV

GN,HN

GP, HP

FG, FH

Tipo de empaque

NL= 100

NK = 1000

NS= 50

NB= 250

No todos los filtros certificados para HPLC son iguales

Es importante entender las diferencias entre filtros certificados para HPLC

Millex®– 0.45 μm

Millex® – 0.2 μm

Vendor 1 – 0.45 μm

Vendor 1 – 0.2 μm

Vendor 2 – 0.45 μm

Filtración de acetonitrilo al 70% en agua análisis del primer ml se analizó por HPLC columna C18 gradiente 0 a 100% acetonitrilo. Análisis a 214 nm.

Volúmenes de retención más bajos

Muestras difíciles de filtrar

​

• ¿Usa más de un filtro para obtener la cantidad de muestra requerida?
• ¿Hace una prefiltración antes?
• ¿Le duele la mano al filtrar por la fuerza?

​

​

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muestras viscosas y / o gran cantidad de material particulado

​

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Samplicity® G2

Beneficios:

• Es un sistema controlado por vacío, por lo que no requiere de fuerza manual para filtrar las muestras.
• Permite filtrar muestras altamente viscosas

en segundos.

• Presenta una mínima cantidad de evaporación del solvente en el proceso de filtración.
• Puede simultáneamente filtrar al vacío hasta ocho muestras en segundos.

​

Por este desarrollo innovador, Merck recibió el Premio R&D Magazine 100 para equipos de laboratorio en 2012.

Samplicity® G2

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El equipo

​

En el equipo:

​

Resolución:

​

• Bajo volumen muerto

​

• No existencias de volumen muerto en las conexiones

​

​

​

Sensibilidad:

​

• Bajo Ruido (motor/sistema)

​

• Buen sistema de lavado – Carry over

​

• Detector muy sensible.

​

​

​

Lámpara

Detección

Chequear la energía regularmente

​

Permitir que la lámpara llegue al equilibrio

Absorbance

Warm-up Time

Drift < 0.4 mAU/hr

Mejorando la técnica

¿Que sigue?

Desarrollo

Eficiencia

Selectividad

Retención

Platos teóricos

Factor de Capacidad

Factor de retención

Número de platos teóricos

Largo de columna

Tiempo

Tamaño de partícula

Presión

Información� muestra

Principios activos de interés

Naturaleza de la muestra

Compuestos de la matriz

Estructura molecular de los activos

Pesos moleculares

pKa del compuesto

Espectro de absorción o propiedad medible

Concentración de cada analito

Solubilidad de los analitos y de la muestra

El factor de retención se modifica, cambiando:

• La polaridad de la fase móvil
• La polaridad de la fase estacionaria
• Tipo de soporte
• Cambio tamaño de partícula
• El área de superficie del soporte
• Recubrimiento
• % de la fase estacionaria
• Tamaño de poro
• Temperatura de la columna

​

Pasos Desarrollo

Cambios en la polaridad de la fase movil

Tipo de Solvente Orgánico

Columna: Fenyl

​

Compuestos: 1.Fluximesterona

2. Dexametasona

3. Hidrocotisona acetato

​

A : ACN/H2O 32:68

​

B: THF/ H2O 36:64

Equivalencia de fuerza de elución

Cambios en la polaridad en la fase estacionaria cambia la selectividad y el factor de capacidad

Columns: 150 x 4.6mm, soporte Sílica

FM: 40/60, MeOH/K2HPO4 (1mM)

Flujo: 1.0 ml/min

Detección: UV 254nm

Temperatura: 25°C

​

analitos: 1. Fenol� 2. 3-Etylanilina� 3. N,N-Dimetylanilina� 4. Tolueno

C4

C8

C18

1

2

3

1

2

3

4

4

1

2

3

4

Tipo de columna

Temperatura de la Columna

Efecto del pH

Efecto de pH

pH de la fase móvil

Compuestos ácidos

Tipos de Modificadores – par ionico

Sales de tetraalquil amonio

Alquil sulfonato

Separación por Gradiente

Un gradiente de elución es aumentar la fuerza dinámica durante el funcionamiento de elución

Se recomienda que se utilizará cuando el K '> 20, o si la muestra presenta un elevado número de componentes o hay una gran diferencia en la K' entre los componentes.

Cuando Usar Gradiente ?

Efecto de la composición inicial

Efecto del tiempo de gradiente

Efecto Conjugado de Tg y % Inicial

Efecto de flujo en Gradiente

Efecto de la Temperatura em el Gradiente

Gracias

Josmelith.Cordero@merckgroup.com Rosario.sanchez@merckgroup.com

We are Merck, a vibrant science and technology company