ОДЕСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені І. І. МЕЧНИКОВА�Біологічний факультет�Кафедра мікробіології, вірусології та біотехнології

��� Синтез сидерофорів у моно- та ко-культурах бактерій Чорного моря

​

С. Мартиненко, магістр I курсу, М. Фіногенова, аспірант

�

​

Науковий керівник: д. б. н., професор

Філіпова Т.О.

​

​

Одеса – 2024

Рис. 3. Сфери застосування сидерофорів

Актуальність теми дослідження

Рис.1. Основні класи сидерофорів [Kramer et al., 2020].

​

Рис. 2. Загальні шляхи транспорту заліза в клітину, опосередковані сидерофорами [Krewulak et al., 2008].

​

Мета роботи: визначення ефективності синтезу сидерофорів морськими бактеріями Чорного моря у моно- та ко-культурах

Завдання:

1. Дослідити синтез сидерофорів монокультурами бактерій родів Bacillus та Pseudomonas, виділених з мідій Чорного моря.
2. Дослідити синтез сидерофорів ко-культурами бактерій родів Bacillus та Pseudomonas, виділених з мідій Чорного моря.

​

Об’єкт дослідження – біотехнологія одержання сидерофорів морських мікроорганізмів.

Предмет дослідження – синтез сидерофорів моно- та ко-культурами, ізольованими з поверхні мідій Одеської затоки Чорного моря бактерій родів Bacillus та Pseudomonas.

Методи та матеріали дослідження

В роботі використовувались загалом шість штамів бактерій. П’ять були виділені з Mytilus galloprovincialis і один був референтним:

Pseudomonas аeruginosa: М1, М3, М4, РА01.

Bacillus subtilis: МС3.

Bacillus atrophoeus: МН4.

Ці штами бактерій проходили монокультивування та ко-культивування (Табл. 1)

Середовищем для культивування бактерій було LB, яке складається з 15 г пептону, 10 г дріжджового екстракту, 5 г NaCl та 1 л морської води.

Культивування відбувалось в конічних колбах, що у випадку монокультивування містили 95 мл LB та 5 мл суспензії добової культури бактерій (OD = 0,2 при 540 нм). У випадку ко-культивування одна колба містила 95 мл LB, 2,5 мл суспензії одних бактерій, 2,5 мл суспензії інших бактерій.

Культивування проводилось при 30 °С протягом 72 годин з перемішуванням 150 об/хв.

​

Таблиця 1

Схема ко-культивування обраних бактерій

​

Методи та матеріали дослідження

Отримана культуральна рідина після культивування проходила центрифугування протягом 20 хв при 3000 об/хв з метою отримання супернатанту.

​

Для визанчення вмісту сидерофрів використали CAS метод:

FeDye + L Dye + FeL,

де L – ліганд (сидерофор), Dye – барвник (хромазурол).

​

Для цього методу готувався спеціальний розчин, що складався з 6 мл

10 мМ HDTMA, 1,5 мл розчину хлориду заліза (ІІІ) (1 мМ FeCl×6H₂O у 10 мМ HCl),

7,5 мл 2 мМ хромазуролу S, 50 мл dH2О та буферу (4 г піперазину, 10 мл dH2О,

6,5 мл 10 М HCl, 5 мл 4 мМ сульфосаліцилової кислоти). Кінцевий об’єм розчину

доводився до 100 мл.

Кількісний аналіз проводився в спектрофотометрі SmartSpec Plus (Bio-Rad, Hungary)

при 630 нм. Для цього до 96-лункового планшету в одну лунку вносили 100 мкл CAS реагенту та 100 мкл супернатанту. Чекали 1 годину й вимірювали оптичну густину розчинів. Для контрольної проби використали замість супернатанту 100 мкл чистого LB.

Вміст сидерофорів виражали в одиницях сидерофорів (SU, %), які розраховували за формулою:

SU (%) = [(Ar - As)/ Ar] ×100,

де Ar – адсорбція контрольної проби (CAS + середовище LB), As – адсорбція дослідної проби (CAS + екстракт).

Статистичний аналіз проводили в Excel. Він включав в себе вирахування Х¯, SХ¯ та t-критерію.

​

​

​

​

​

Рис. 1. Метод CAS агару [Schwyn, 1987].

Результати дослідження

Таблиця 1

Вміст сидерофорів у монокультурах досліджуваних бактерій

Таблиця 2

Вміст сидерофорів у ко-культурах досліджуваних бактерій

Результати дослідження

Рис. 2. Порівняння реального вмісту сидерофорів у ко-культурах B. subtilis МС3 з різними штамами P. аeruginosa з очікуваним.

Примітка: * - різниця достовірна у порівнянні з очікуваними даними

Результати дослідження

Рис. 3. Порівняння реального вмісту сидерофорів у ко-культурах B. atrophoeus МН4 з різними штамами P. аeruginosa з очікуваним

Примітка: * - різниця достовірна у порівнянні з очікуваними даними

• Встановлено, що у монокультурах штами Pseudomonas синтезують у 1,7-3,1 рази більше сидерофорів ніж штами Bacillus.
• Показано, що вміст сидерофорів у ко-культурах є більшим у порівнянні з монокультурами. Найбільш ефективними виявилися консорціуми (B. subtilis МС3 + P. aeruginosa М1) та (B. subtilis МС3 + P. aeruginosa М4).
• Встановлено, що реальний вміст сидерофорів у ко-культурах значно перевищує розрахунковий: на 30-40 %.

Висновки

Дякую за увагу!