REPLICACIÓN DEL ADN

En 1928, Friedrich Griffith utilizó dos cepas de bacterias Streptococus pneumoniae :

(cepa S: smooth), cuyas colonias eran de superficie lisa y producían la muerte de ratones.

(cepa R no encapsulada (rough), cuyas colonias tienen una superficie rugosa y que no mataban a los ratones.

Observaciones de Griffith:

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• La cepa S producía infección letal en los ratones de su laboratorio y los de la cepa R, no lo hacían.
• Las cepas S muertas por calor son también inofensivas, excepto cuando se las mezcla con cepa R vivas.
• En este último caso, se puede producir una infección fatal y en los ratones infectados se encuentran células vivas con cápsulas características de la cepa S.
• Este experimento permite inferir que algún factor de la cepa S muerta pasa a las cepas R vivas y las transforma en cepas infecciosas letales.
• Griffith no supo cual era ese factor.

Experimentos de Griffith

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Experimento de Avery (1944)

El neumococo tipo R (rough, rugoso) (colonias a la izda.) puede ser transformado en neumococo tipo S (smooth, liso) (colonias a la dcha.) por el DNA del neumococo S. Esta transformación se transmite a la descendencia.

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• En los años 40, Oswald Avery, Colin MacLeod, y Maclyn McCarty revisaron el experimento de Griffith y concluyeron que el factor de transformación era el ADN.

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• Oswald Avery repitiendo el trabajo de Griffith con el agregado de una enzima que destruía el ADN, demostró que el factor de transformación era el ADN.

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• Cuando Avery agregaba esta enzima, no observaba la transformación obtenida por Griffith.

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• Concluyó que el material hereditario era ADN y no una proteína.

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• Su evidencia era fuerte pero no totalmente concluyente, para esa época el "candidato principal" para ser el material hereditario eran una proteína.

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En los años 40 (19..), Oswald Avery, Colin MacLeod, y Maclyn McCarty revisaron el experimento de Griffith y concluyeron que el factor de transformación era el ADN. Oswald Avery repitiendo el trabajo de Griffith con el agregado de una enzima que destruía el ADN, demostró que el factor de transformación era el ADN. Cuando Avery agregaba esta enzima, no observaba la transformación obtenida por Griffith. El concluyó que el material hereditario era ADN y no una proteína. Su evidencia era fuerte pero no totalmente concluyente, para esa época el "candidato principal" para ser el material hereditario eran una proteína.

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Experimentos de Hershey y Chase

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• En 1952, Hershey y Chase estaban estudiando el ciclo de vida del bacteriófago T2. Dado que el T2 esta compuesto casi completamente de ADN y proteína, el objetivo era determinar el destino del ADN y la proteína durante la infección. Para ello, hicieron crecer células infectadas por T2 en presencia de isótopos radiactivos (S³⁵ y P³²).

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• Cuando se hacían crecer células infectadas por T2 en presencia de S³⁵, se producían virusT2 con proteína marcada.
• Similarmente, cuando las células infectadas con T2 se hacían crecer en presencia de P³², el virus contenía ADN marcado.

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• Los investigadores encontraron que casi toda la proteína radiactiva permanecía fuera de la célula infectada y que podía ser eliminada sin que se interrumpiera la infección, mientras que el ADN del fago entraba en la célula infectada.

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• Dado que los genes de T2 pueden controlar la maquinaria de una célula infectada, dedicándola a producir nuevos bacteriófagos T2, se deduce que si es el ADN del fago, y no su proteína, lo que entra al hospedador, el ADN debe llevar información genética.

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Replicación del ADN

• Es el proceso necesario para que se realice la división celular.
• Ocurre en la fase S del ciclo celular.
• El mecanismo de replicación se basa en la complementariedad de bases.
• Inicialmente se plantearon tres posibles modelos de replicación:
• Modelo conservativo
• Modelo dispersivo
• Modelo semiconservativo

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Posibles modelos en la replicación del ADN

CONSERVATIVO

DISPERSIVO

SEMICONSERVATIVO

Experimento de Meselson y Stahl

ADN ¹⁴N

ADN ¹⁵N

1ª generación

2ª generación

3ª generación

INTERPRETACIÓN DEL EXPERIMENTO

Cultivo con ¹⁵N

Cultivo con ¹⁴N

1ª generación

2ª generación

3ª generación

ADN ¹⁴N y ADN ¹⁵N

http://biologia.uab.es/genomica/swf/dna.htm

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• Proceso de duplicación del ADN mediante un modelo semiconservativo.
• Comienza en sitios específicos (orígenes de replicación)
• El proceso de replicación es bidireccional
• Las dos hebras nuevas se van alargando progresivamente, por adición secuencial de nucleótidos
• La replicación siempre se produce en sentido 5' → 3', siendo el extremo 3'-OH libre el punto a partir del cual se produce la elongación del DNA.
• Como las dos hebras de ADN son antiparalelas, una de las hebras se sintetiza de forma continua y otra de forma discontinua.
• El proceso de duplicación está catalizado por las enzimas ADN polimerasas (aunque intervienen muchas otras enzimas en el proceso)
• Hay una corrección de errores para asegurar la fidelidad de las copias

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• El proceso se ha estudiado en la bacteria E. Coli
• Consta de las siguientes fases:
• Iniciación
• Elongación
• Terminación

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• Durante la elongación se da una corrección de errores

• El proceso de replicación de DNA es el mecanismo que permite al DNA duplicarse (es decir, sintetizar una copia idéntica).

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• Esta duplicación se produce según el modelo semiconservativo, lo que indica que las dos cadenas complementarias del DNA original, al separarse, sirven de molde cada una para la síntesis de una nueva cadena complementaria de la cadena molde.

Existen cinco tipos de ADN polimerasas (, , , , y  ).

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Los orígenes de replicación son los puntos fijos a partir de los cuales se lleva cabo la replicación, que avanza de forma secuencial formando estructuras con forma de horquilla.

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• Procariontes: Un origen de replicación.
• Eucariontes: Múltiples orígenes de replicación.

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El DNA se replica desenrollando la hélice y rompiendo los puentes de hidrógeno entre las hebras complementarias.

La replicación comienza en sitios específicos del ADN conocidos como “origen de replicación” o región oriC.

El DNA se replica desenrollando la hélice y rompiendo los puentes de hidrógeno entre las hebras complementarias.

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Se forma la burbuja de replicación, con dos horquillas de replicación, que se van extendiendo en las dos direcciones: replicación bidireccional

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Comienza la fase de elongación.

Fases de la replicación: iniciación

Consiste en el desenrollamiento y apertura de la doble hélice de ADN

• Reconocimiento del OriC por proteínas especificas
• Las helicasas rompen los puentes de H
• Las girasas y topoisomerasas alivian las tensiones del desenrollamiento.

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• Las proteínas SSB evitan que se vuelvan a unir las cadenas sencillas y se enrollen de nuevo
• Formación de la burbuja de replicación

Se sintetiza la nueva hebra de ADN sobre la hebra original.

Se debe a la actuación de las ADN polimerasas. En procariotas hay tres y su función es doble:

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• Actividad polimerasa. Va uniendo los desorribonucleotidos trifosfatos complementarios a la cadena original.

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• Actividad exonucleasa. Elimina nucleótidos mal emparejados y trozos de ARN cebador

La ADN polimerasa no puede actuar desde un principio, necesita un pequeño fragmento sobre el que empezar a añadir nucleótidos.

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Este primer fragmento es un trozo de unos 10 nucleótidos de ARN llamado cebador o primer, que presenta el extremo 3’ libre

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El primer es sintetizado por una ARN polimerasa o primasa, que actúa en la zona donde comienza la replicación.

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A partir de este fragmento, la ADN polimerasa comienza la adición de nucleótidos sobre el extremo 3’ libre.

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Este enzima recorre la cadena molde en sentido 5’→3’ y sintetiza la nueva cadena en sentido 3’→5’ (las cadenas de ADN son antiparalelas)

El mecanismo de elongación es distinto en las dos cadenas:

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• En una de las cadenas, la hebra conductora, la síntesis es continua.

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• En la otra cadena, la hebra retardada, se produce una síntesis a base de pequeños fragmentos de ADN (fragmentos de Okazaki).

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• La síntesis de cada uno de los fragmentos de Okazaki necesita de su cebador correspondiente (sintetizado por la primasa).

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• Los cebadores serán posteriormente eliminados por la ADN polimerasa I que rellena el hueco con desoxirribonucleotidos.

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• Finalmente una ligasa une los fragmentos sueltos.

3’

5’

El mecanismo de elongación

5’

3’

3’

5’

3’

La ADN polimerasa recorre las hebras molde en el sentido 3’-5’ uniendo los nuevos nucleótidos en el extremo 3’.

El mecanismo de elongación

La primasa sintetiza un cebador en cada hebra conductora de la burbuja de replicación.

Las ADN polimerasa comienzan la síntesis de la hebra conductora por el extremo 3’ de cada cebador.

La primasa sintetiza un nuevo cebador sobre cada hebra retardada.

La ADN polimerasa comienza a sintetizar un fragmento de ADN a partir del nuevo cebador.

Cuando la ADN polimerasa llega al cebador de ARN, lo elimina y lo reemplaza por ADN.

La ligasa une los fragmentos de ADN.

La replicación termina cuando se unen todos los fragmentos de Okazaki de la hebra retardada

• Durante la replicación se puede producir un error en el apareamiento de bases con una tasa de 1/100.000 bases.
• Parte de estos errores se corrigen durante la replicación. La ADN polimerasa actúa como exonucleasa y elimina los nucleótidos mal apareados y rellena el hueco con los nucleótidos correctos.
• La ADN ligasa une los fragmentos resultantes.
• A pesar de todo, siempre quedan algunos errores (mutaciones)

Replicación en los eucariontes

Es muy parecida a la de los procariontes, salvo en algunas diferencias debidos a las propias diferencias en el material genético de procariotas y eucariotas:

• El material genético de eucariotas esta dividido en varios cromosomas, mucho mas largos que el cromosoma procariota.
• La replicación se origina simultáneamente en muchos puntos: los replicones (puede haber mas de6000 en un solo cromosoma).
• Existen cinco tipos de ADN polimerasas (, , , , y  ).
• El ADN eucariota está asociado a histonas, que se tienen que duplicar durante la duplicación para formar los nucleosomas.

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Replicación en los eucariontes

Cuando se elimina el último cebador, la ADN polimerasa no podrá rellenar el hueco, al no poder sintetizar en dirección 3’ - 5’.

5’

5’

5’

3’

5’

Esto se asocia al envejecimiento y muerte celular.

5’

Debido a esto el extremo del cromosoma (telómero) se va acortando cada vez que la célula se divide.

Se puede dar de dos formas: Necrosis y apoptosis

Necrosis:

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• Se produce cuando la célula sufre un daño grave.
• Comprende un estado irreversible de la célula. No se puede mantener la integridad de la membrana plasmática y hay un escape de elementos citoplasmáticos, desnaturalización de las proteínas por autólisis o proveniente de enzimas líticas de leucocitos vecinos, ya que la necrosis atrae los componentes de la inflamación.
• Todos estos cambios condenan a la célula a perder su función específica, y quedan restos celulares que serán fagocitados por los macrófagos.

La apoptosis es una forma de muerte celular, que está regulada genéticamente.

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Es parte integral del desarrollo de los tejidos tanto de plantas como de animales pluricelulares.

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Cuando una célula muere por apoptosis, empaqueta su contenido citoplasmático, lo que evita que se produzca la respuesta inflamatoria característica de la muerte accidental o necrosis.

La apoptosis se puede producir en dos momentos:

Durante el desarrollo embrionario: en este momento su función es eliminar las células innecesarias (como el tejido interdigital en la formación de los dedos)

En un individuo adulto: para el recambio y renovación de tejidos, o la destrucción de la células que pueden presentar una amenaza para el organismo.

La apoptosis implica varios cambios en la célula:

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Cuando las células reciben la señal del inicio de apoptosis se suicidan fabricando una serie de proteínas letales como pueden ser:

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- Endonucleasas; que fragmentan el ADN

- Hidrolasas y proteasas: que atacan al entramado celular.

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