MAZTER-seq, el codigo de m6A de levadura a mamíferos, �y la experiencia de mi doctorado en Israel.

Dr. Miguel Garcia

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Postdoc en el Laboratorio Schwartz Depto. Genética Molecular

Instituto Weizmann de Ciencia

Marzo 2022

Presentación para: Universidad Técnica de Ambato

Outline

1. MAZTER-seq and the m6A code: A technology to quantify the most abundant mRNA modification, and a model to predict its deposition.
2. Doctorado en Israel.
3. Herramientas del científico computacional moderno.

MAZTER-seq�and the m⁶A code

m⁶A is everywhere

• The most abundant modification in eukaryotic mRNA.
• Thousands of sites per transcriptome.
• Plays a role in mRNA stability, processing, translation efficiency.
• It’s perturbation is associated to embryo arrest, cancer, neurodegenerative disorders, and efficiency of infection of RNA viruses.

m⁶A technology took a leap with antibody-based high-throughput profiling

• 1974: Discovery

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• 2012: �Antibody-based high-throughput detection technology

IP-based methods have several limitations

• Limited utility for quantification of m6A stoichiometry
• Limited specificity: due to promiscuous binding (Schwartz et al., 2013). 
• Unknown sensitivity: not be evaluated in the absence of an orthogonal technique allowing independent systematic profiling of m6A. �

RNA

Additional limitations of IP-based m6A detection

• Limited resolution 
• Requirement for large amounts of starting material. 

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Although there have been improvements to alleviate previous limitations, no protocol existed providing complex, single-nucleotide resolution m6A mapping and quantification from limited starting mRNA material.

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2019:

MAZTER-seq an m⁶A quantification technology

• Established MAZTER-seq, a method that uses RNA digestion via the m⁶A sensitive RNAse mazF for high-throughput m⁶A quantitation in a complex RNA pool.

RNA

Dr. Sarit Edelheit Flohr

ACA

ACA

mazF

MAZTER-seq quantitatively captures methylation levels

MAZTER-seq’s cleavage efficiency estimations are highly reproducible.

ACA

ACA

ACA

ACA

RNA

ACA

88 nt

Quantifying m6A in yeast

Input

IP

Input

IP

rep1

rep2

rep1

rep2

rep1

rep2

rep1

rep2

Experimental design

Pair-wise correlation (MAZTER-seq data)

MAZTER-seq quantitations at known m6A sites

Distribution of cleavage efficiencies (y-axis) at known m6A sites in RNA extracted from WT ime4Δ/Δ strains with versus without m6A-IP treatment

mazF biases are removed in �Δ Cleavage efficiency

De novo m6A detection

Input

IP

Input

IP

rep2

rep1

rep2

rep1

rep2

rep1

rep2

1

2

3

We used three comparisons to detect m6A sites with high confidence.

De novo m6A detection

Distribution of m6A-seq sites across the confidence groups defined via MAZTER-seq

Distribution of m6A-seq scores from (Schwartz et al., 2013) by MAZTER-seq confidence groups.

SCARLET validation of new m6A sites.

Validation rate 12 /14

M.Sc Ursula Toth

Prof. Walter Rossmanith

Medical University of Vienna

The m6A code

Model-derived coefficients value for each nucleotide at a given position

Relative importance of variables. Difference in the full model R² when removing each of the variables one-in-one-out.

The m6A code

Variability of methylation levels can be predicted via local sequence and secondary structure information in both new and previously detected sites.

SCARLET quantifications and m6A levels predictions highly correlate

Model is able to predict m6A sites

Top predicted sites have a clear separation from background in m6A-seq derived data (Schwartz et al., 2013).

SCARLET validation of high-scoring predicted sites (5 out of 5)

m6A-Seq score

MAZTER-seq in mouse

1

MAZTER-seq in mouse

MAZTER-seq derived stoichiometries in Mouse Embryonic Stem Cells

Stoichiometries are highly predictable by sequence information

New sites in mouse

MAZTER-seq detection groups

Antibody-based measurements show enrichment in detection groups

m6a-seq IP dependent detection is influenced by its stoichiometry

m6A-seq antibody-based detection is influenced by stoichiometries as an stochastic sampling

The m6A code in mouse

Similarly to the yeast model. The mouse stoichiometry model favors A in -4, G at -2 and -1, and T in +3 and +4 positions

Relative importance of variables

The m6A code is conserved

Yeast

MAZTER-seq is able to quantify m6A across genetic perturbations

FTO over expression nor deletion seem to affect m6A levels

ALKBH5 over-expression reduces m6A levels��METTL3 deletion dramatically decrease m6A levels

Summary

• MAZTER-seq is able to de novo detect and quantify m6A stoichiometries with single-nucleotide resolution in a complex pool of RNA.
• m6A modification levels are predictable based on a code in cis, and they are specially dependent on their surrounding sequence.
• The m6A code is conserved in eukaryotes of very distant species, yeast to mouse.

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Mi experiencia de doctorado en Israel

Aplicar a un doctorado internacional

• Lista de asesores potenciales
• Ordenarlos por preferencia personal y buscar entrevistarse con el top 3.
• CV + Carta de motivo.
• De ser posible, entrevistarse con algunos miembros del laboratorio (estudiantes y/o trabajadores).

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Ventajas competitivas al aplicar

• Publica un paper. Cuanto antes mejor, aunque sea de “bajo impacto”.
• Habilidades duras o técnicas:
• Programación
• Estadística
• Matemáticas aplicadas al área
• Habilidades blandas:
• Organización en el trabajo
• Contactos
• Exposición a otros paises y colaboradores

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Proceso de adaptación

• Idioma
• El idioma puede ser una barrera social muy fuerte.
• Cultura de trabajo
• En Israel la jerarquía es más horizontal que en América Latina
• Cultura de vida
• La cultura Israelí es muy diferente de la Mexicana y hubo un proceso de adaptación que tomo al menos un año
• Compañeros de trabajo y área de trabajo
• Entre mayor comunicación y más acuerdos de trabajo, mejor.
• Balance trabajo/vida
• Administrar tu tiempo
• Desarrollar hobbies que te motiven

Vida académica �y logros

• Múltiples proyectos “fallidos” o truncos, pero también algunos proyectos “exitosos”.
• 4 semestres como asistente de enseñanza en el lenguaje de programación R enfocado a ciencias biológicas.
• 4 artículos publicados, uno en “Cell”.
• Premio “Laddy Ann Chain” a la excelencia académica durante estudios de doctorado.
• 2 artículos en preparacióny un “mega-proyecto” en progreso.

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Vivencias

• Conocer y vivir la cultura de un país diferente.
• Amigos de todo el mundo.
• Viajar a otros países,�además de Israel.
• Desarollarme como�ser humano.

Algunas herramientas del científico computacional moderno

Inglés

• Fundamental para competencia internacional. Y la mejor inversion de tiempo y esfuerzo que he hecho.

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Programación

• Permite:
• Realizar tareas digitales mecánicas o laboriosas de forma rápida y automatizada.
• Manipular, procesar y analizar datos masivos.
• Generar gráficos para visualizer datos o resultados.
• Reproducibilidad del trabajo científico�(datos + código = resultados).

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Programación�Python y R

• Coursera es un gran recurso y de acceso completamente gratuito (si sabes donde dar click).

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• Bioconductor. Un repositorio de paquetes de R enfocados en ciencias de la vida.
• R notebooks. Documentos en los que se integra código de R y lenguaje natural (Español o Inglés), conteniendo tanto la explicación y el método computacional del proyecto.

Técnica pomodoro y KanbanFlow

• La técnica pomodoro. Es un método de administración de tiempo desarrollado�en los 80s por Francesco Cirillo.
• Consta de intervalos de trabajo �de 25 minutos y pausas de 5 �minutos entre “pomodoros”.
• Al finalizar cuatro �pomodoros, se toma un descanso más largo (~20 minutos).
• Promueve el trabajo intenso, enfocado y eficiente, previniendo el agotamiento.

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KanbanFlow.com

• Plataforma para organizar tareas y utilizar el método pomodoro sin costo.

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Toda � raba!

Contacto

• Sitio: https://angelcampos.github.io/
• Correo electrónico: angel.campos@ciencias.unam.mx