Аналіз поліморфізму Gli-A1 локусу в сортах твердої пшениці (Triticum durum Desf.)

Студентка ІІІ курсу

денного відділення

Школіна Катерина Сергіївна,

Консультант док. Філософії Попович Ю.А.,

Керівник проф. д.б.н. Чеботар С.В.

​

Вступ

• Пшениця є другою за величиною зерновою культурою в світі за площею посіву зерна та загальним обсягом виробництва.
• Тверда пшениця наразі є другою за значенням культурою пшениці та десятою за значенням культурою у світі, яка включає близько 6% площі посіву пшениці та її річне виробництво становить 37-40 мільйонів тонн станом на 2023 рік.
• Зовсім нещодавно геном сучасної твердої пшениці сорту Svevo було повністю секвеновано, що полегшило ідентифікацію багатьох γ-гліадинів. На прикладі Svevo досліджено філогенетичний зв’язок генів γ-гліадину та проведено молекулярну характеристику генів γ-гліадину й кодованих ними білків, при цьому особливу увагу науковці приділили вмісту та розподілу епітопів целіакії [Paris et al., 2021].

​

• Мета роботи: за допомогою ПЛР-аналізу визначити алельний стан Gli-A1 локусу у низки українських сортів твердої пшениці (Triticum durum Desf).
• Для досягнення мети поставлені наступні завдання:

1. Ізолювати ДНК з низки українських сортів твердої пшениці.

2. Провести ПЛР-аналіз Gli-A1 локусу з праймерами розробленими Zhang et al. [2003].

3. Провести фракціонування продуктів ПЛР з 7% ПААГ.

4. Визначити молекулярну вагу продуктів ампліфікації й алелі за Gli-A1 локусом в генотипах сортів твердої пшениці.

• Об’єкт дослідження: гліадин-кодуючі локуси Gli-A1 пшениці твердої.
• Предмет дослідження: поліморфізм генів γ-гліадинів, що кодуються Gli-A1 локуcом Triticum durum Desf.
• Актуальність:Тверда пшениця є тетраплоїдним видом і порівняно з гексаплоїдною хлібною пшеницею не має генома D; таким чином, фрагменти, еквівалентні 33-мерному фрагменту, відсутні в клейковині твердої пшениці, що знижує вірогідність розвитку такої хвороби, як целіакія.
• Послідовно існують докази того, що тверда пшениця та інші тетраплоїдні види демонструють нижчу імунореактивність порівняно з хлібною пшеницею, і що в цих видах загальна відповідь Т-клітин спрямована на γ-епітопи [Pourmohammadi et al., 2023].
• Інформація, отримана в цьому дослідженні, може допомогти в подальших дослідженнях функцій білка гліадину та майбутніх селекційних програмах, спрямованих на відбір нових більш здорових генотипів твердої пшениці.

​

Гліадинкодуючий локус Gli-A1 Triticum durum Desf.

• Гліадинові локуси Gli-1 знаходяться на дистальних ділянках коротких плеч хромосом першої гомеологічної групи [Shandhu et al., 2002; Qi et al., 2004; Dilbirligi et al., 2004]
• Базовий каталог блоків гліадинів та відповідних алелів локусів запасних білків пшениці твердої (BBAA) склав Кудрявцев [2007]. У каталог входили блоки, кодовані 10 алелями локусу Gli-A1d.
• Дослідження 700 сортів пшениці твердої з 45 країн світу дозволили ідентифікувати більшу кількість алелів основних гліадинових локусів, зокрема 16 алелів локусу Gli-A1d [Melnikova et al., 2012].
• З тим же, як і в пшениці м`якої, гліадинові алелі пшениці твердої можна об’єднати в родини за подібністю блоків, які вони кодують, які, ймовірно, виникнули з предкового алеля, наприклад, алелі e, ea, eb, ec локусу Gli-A1. [Melnikova et al., 2012].
• Також відомо, що з локусами Gli-1 зчеплені гени морфологічних ознак колоса. З локусом Gli-A1 тісно зчеплений ген Hg опушення колоскових лусок [Панін та Нецветаєв, 1986; Собко та Созинов, 1993, 1997; Khlestkina et al., 2006; Luo et al., 2016]
• В іншій роботі [Собко и Созинов, 1997] було визначено, що ген Hg знаходиться дистально від Gli-A1 і частота рекомбінації між цими локусами – 0,3–2,2%.

​

Рис.1. Діаграма блоків алельних варіантів компонентів гліадину твердої пшениці для локуса Gli-A1 [Melnikova et al., 2011 ]

Алель-специфічна ПЛР у генотипуванні SNP

• Алель-специфічна полімеразна ланцюгова реакція (AS-PCR), також відома як стійка до ампліфікації мутаційна система (ARMS) або ПЛР-ампліфікація специфічних алелів (PASA) є методом на основі ПЛР, який можна використовувати для виявлення SNP.
• Концепція AS-PCR була започаткована Ньютоном, приблизно через шість років після винаходу ПЛР.
• AS-PCR є швидким, недорогим і специфічним методом для генотипування однонуклеотидних поліморфізмів. [Darawi et al., 2012].
• У AS-PCR використовується Taq ДНК-полімераза, яка не має 3'-5' екзонуклеазної активності. Таким чином, фермент не корегує праймерні 3'-кінцеві нуклеотиди, які утворюють невідповідні пари основ з матричною ДНК.
• ДНК-полімераза ефективно ампліфікує цільову ДНК лише тоді, коли праймер повністю комплементарний цільовій послідовності ДНК. І навпаки, ПЛР-ампліфікація стійка до невідповідностей на 3'-кінці праймера. [Wang et al., 2010].
• Після ПЛР та електрофорезу моделі специфічних продуктів ПЛР дозволяють диференціювати SNP [Darawi et al., 2012].

​

Матеріали

• В роботі досліджували 8 сучасних українських сортів пшениці твердої селекції Селекційно-генетичного інституту – національного центру насіннєзнавства та сортовивчення.

​

* - відмічено роки вирощування у вробництві

• Екстракцію ДНК більшості сортів здійcнювали із половинок сухого зерна пшениці, за модифікованою методикою з використанням лізуючого буферу зі СТАВ.

Таблиця 1

Нуклеотидні послідовності праймерів, що використовувалися у дослідженні

Для аналізу поліморфізму Gli-1 локусів використовували праймери розроблені Zhang et al. [2003].

Ці праймери дозволяють виявити два алелі – Gli-A1.1 та Gli-A1.2 за наявністю SNP поліморфізму.

* F – прямий праймер, R – зворотній праймер

ПЛР-аналіз Gli-A1 локусу

Таблиця 2

Gli A1.1

Рис. 2. Електрофореграма продуктів ампліфікації ПЛР із алель-специфічними праймерами до алеля Gli-A1.1 у сортів пшениці твердої.

ДНК сортів: 1,2 – Янтар одеський, 3,4 – Факір одеський, 5,6 – Фактор одеський, 7,8 – Гавань, 9,10 – Шляхетний, 11,12 – Алий парус, 13,14 – Дельфін, 15,16 – Сріблястий, М – маркер молекулярної ваги pUC19/MspI, К – контроль (Mironovskaya-808).

Результати

Gli A1.2

Рис. 3. Електрофореграма продуктів ампліфікації ПЛР із алельспецифічними праймерами до алеля Gli-A1.2 у сортів пшениці твердої.

ДНК сортів та ліній: 18,19 – Янтар одеський, 20,21 – Факір одеський, 22,23 – Фактор одеський, 24,25 – Гавань, 26,27 – Шляхетний, 28,29 – Алий парус, 30,31 – Дельфін, 32,33 – Сріблястий, М – маркер молекулярної ваги pUC19/MspI, К – контроль (Recital).

​

​

Результати

Висновки

• За результатами ПЛР з алель-специфічними праймерами до Gli-A1 локусу, виявлено: фрагменти ампліфікації 168 п.н. для алеля Gli-А1.1 в сортах Факір одеський та Фактор одеський. Gli-А1.2 алель виявлено в сортах Янтар одеський, Факір одеський, Фактор одеський, Гавань, Шляхетний, Алий парус, Дельфін та Сріблястий. Більшість сортів мала алель Gli-А1.2.
• Для сорту Фактор одеський визначено наявність Gli-А1.1 та Gli-А1.2 алелів одночасно, що потребує додаткових досліджень.

​

​

​

Дякую за увагу!