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Produção de Vacinas

Prof. Dr. Júlio César dos Santos

DEBIQ- Setembro/2023

Universidade de São Paulo

Escola de Engenharia de Lorena

EEL-USP

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Histórico

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Século XVIII – 1796

EDWARD JENNER

VARÍOLA BOVINA

VARÍOLA HUMANA

VACINA CONTRA VARÍOLA

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VACINAS QUE REVOLUCIONARAM A HISTÓRIA...

1804 - Brasil

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A imunologia estuda os mecanismos de defesa do organismo

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Sistema Imunológico

Imunização Passiva e ativa:

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A forma passiva pode ocorrer por via natural ou artificial
A forma natural- passagem de imonoglobulinas/ anticorpos pela amamentação ou placenta
A forma artificial- ocorre por soroterapia, ou seja, o emprego emergencial por via intravenosa;
A Imunização passiva: soros de indivíduos com o vírus, por exemplo, para raiva e hepatite B

A IMUNIZAÇÃO ATIVA: pode ocorre pela instalação da doença BRANDA.

Natural
Vacinas 🡪 imunidade ativa artificialmente adquirida

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Classificação das vacinas...

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CLASSIFICAÇÃO DAS VACINAS

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Tabela-1. Classificação das principais vacinas utilizadas no Brasil

Vacinas	Exemplos
Atenuadas (antígeno vivo atenuado)	Tuberculose BCG Pólio oral VOC Sarampo Caxumba Rubéola Varicela, Rotavírus, Febre amarela
Inativadas ( antígeno morto)	Pertussis célula inteira (wP) Polio vírus inativa (VIP), Raiva
Subunidades ( antígeno purificado)	Polissacarídeo	Meningocócica sorogrupos A, C, W135 e Y Pneumocócica 23-valente
	Polissacarídeo conjugado	Haemophilus influenzae tipo b (Hib), Meningocócica sorogrupos A, C, W135 e Y Pneumocócicas
	Anatoxina (toxina inativa)	Tétano, difteria
	Proteína Inativa	Pertussis acelular (aP)
	Proteína recombinante	Hepatite B (Hep B) Papanicolau (HPV)

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Desenvolvimento de vacinas:

CULTIVO – Crescimento das células e expressão de componentes específicos. Principal desafio: garantir seu escalonamento, e que sua resposta clínica seja igual à obtido em escala piloto;
Por isso é necessário rigoroso controle de qualidade.
É necessário uso de conservantes, estabilizantes, adjuvantes

Bactérias

Vírus

Recombinantes

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Processo de produção de vacinas:

Identificar o antígeno – determinante antigênico- Fase de Investigação
Produção – e envio para fase I e desenvolvimento de BPF (Boas práticas de Fabricação)
Eficácia em animais – fase pré-clínica, e estudo em humanos - fase clínica I, II, III, IV
Linha de produção e aprovação para o mercado.

PROCESSO COMPLEXO
Estratégia: melhor relação custo-benefício;
Objetivo: licenciar um produto seguro, imunogênico e efetivo;
Produção: consistente, mais rápida possível e baixo custo;
Antígeno: vivo atenuado, inativado, fragmentado, DNA recombinante;
Mimetizar a resposta natural – produzir anticorpos
Adjuvantes
Formas de aplicação: fácil de administrar

Investimento: 10 M – 1 B; 1 – 20 ANOS

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Desenvolvimento de vacinas:

Identificação antígenos

Produção de antígenos

Teste em animais

Prova de Conceito

Fase I, Fase II, Fase III

Relatório

Registro farmacovigilância

Processamento: produto que foi fermentado, cultivado,. Separação do determinante antigênico da matéria prima utilizada. Separação das células, qndo não se utiliza a célula, apenas o sobrenadante q contenha o determinante antigênico. Pode-se usar equipamentos com membranas ou centrígugas.

Destoxificação, qndo se usa a células elas precisam ser destoxificadas, tem q ser inativada. Com formaldeído, espera-se 25 a 35 dias para a detoxificação.

Qndo se usa a célula, as vzs precisa romper a célula, por processo de desintegração.

Volume de trabalho é grande, 500 l, 1000l, então faz-se a concentração desse material, cacete de membrana, fazer uma diafiltração

Após essa etapa, faz-se uma melhor purificação, ultracentrifugas, cromatográfica.

filtração esterilizante, remove possíveis contaminantes

Produto concentrado

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Processo de produção de vacinas:

Meios de cultura complexo

Volumes de meio de cultivo na produção industrial de vacinas (25 a 3500 L)

Temperatura de cultivo 37 ºC

pH ótimo 7,0 – 7,5

Análise do crescimento do microrganismo de interesse

Assepsia na condução do processo

Patogenicidade dos microrganismos envolvidos

Proteção do operador

Efeitos colaterais decorrentes da aplicação da vacina devem ser minimizados

Análise dos efeitos em animais de laboratório

PROBLEMAS:

ELEVADA PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS DURANTE OS CULTIVOS;

ESPUMA;

ESCALONAMENTO

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PRODUÇÃO DE VACINAS BACTERIANAS

Isolamento do microrganismo

Pré-cultivo bacteriano

Fermentação e centrifugação

Purificação

Filtração Esterilizante

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Desenvolvimento de vacinas Bacterianas BCG:

O Antígeno provém da própria bactéria (Mycobacterium tuberculosis) atenuada;
BCG: bacilo foi isolado de uma vaca. Essa vacina é de baixo custo
É necessário cultivo do bacilo a 37ºC em frascos estáticos, onde se desenvolve uma película na superfície do meio líquido, a fermentação ocorre entre 6 a 9 dias,
Após essa etapa o cultivo é coletado, filtrado e homogeneizado em moinho de bolas; assim as células são ressuspensas em meio estéril e homogeneizadas em temperaturas controladas,
Todo processo passa por controle de qualidade

Bactérias

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Processo de produção de vacina diftérica:

Essa vacina, que começou a ser produzida em 1930, é segura e eficaz , com um processo simples de produção ;
Corynebacterium diphtheriae é um bacilo Gram-positivo, capaz de produzir a toxina in vitro, com alta concentração de ferro. No entanto, o excesso de ferro pode inibir o processo

PROCESSO COMPLETO
O pH ideal para esse processo é de 7 a 8 . A produção de toxina ocorre a partir de substrato que pode ser a maltose (dissacarídeo),
Glicose: necessário o controle do pH, pois há rápida liberação de ácidos no meio;
Produção: meio semissólido de Loefler, em incubadora a 35ºC por 24 horas; posteriormente, emprega-se o inóculo com dois repiques sucessivos em meio líquido com intervalos de 24 horas, transfere-se para o reator de 500L por 64 horas.
-agitação em vórtice

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Características produção de vacina Tetânica:

A cepa do C. tetani deve ter origem conhecida, verificando-se as características bioquímicas e genéticas
O Cultivo do C. tetani requer condições específicas ambientais e de infraestrutura devido a formação de esporos termoestáveis
A Toxina tetânica gera a necessidade de área de isolamento tipo III

De forma geral, a maioria dos produtores inicia o cultivo com a ressuspensão de um liofilizado do bacilo em meio tioglicolato em condição de anaerobiose, por 36 horas a 36ºC; na sequência, há o repique no mesmo meio e cultivo por mais 24 horas
A propagação do inóculo é realizada em frascos até 7000 mL contendo meio tioglicolato, incubados a 36ºC
Biorreatores de 420L, 88h

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Processo de produção de vacina tetânica:

Após o término da etapa de fermentação , a toxina tetânica pode ser purificada e depois destoxificada com formaldeído , ou de forma inversa, destoxificada e posteriormente purificada

PROCESSO COMPLETO
A Figura 1 apresenta as duas possibilidades de processamento da toxina tetânica. A toxina tetânica purificada é, então acondicionada à temperatura de 2ºC a 8ºC. As vantagens e desvantagens de cada metodologia são similares para a anatoxina diftérica.

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Desenvolvimento de vacina tetânica:

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Outro aspecto importante é a homogeneização do cultivo, que deve ser realizado de forma suave sem que ocorra a incorporação dos gases metabolismo. Realizado pelo vibromixer ou vibro misturador Figura 2.

Figura 2- A- Diagrama esquemático do vibromisturador no interior do biorreator. B- Vista superior do disco agitador. C: Vista lateral expandida do disco agitador mostrador o sentido do fluxo do meio no interior do biorreator.

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Vacinas Pertussis

Essa vacina previne a coqueluche, a vacina celular é composta de suspensão de células inteiras inativas de uma ou mais cepas;
As cepas deve contém células da fase exponencial de crescimento, pode utilizar o meio sólido de Stainer e Scholte e é acompanhado com controle de qualidade do processo para avaliar a atividade do ágar-sangue;
A suspensão bacteriana é submetida à filtração tangencial e posterior ressuspenção em solução salina, e depois é passado pelo processo de inativação que pode se por formaldeído ou calor;
Nenhuma toxina ativa deve ser detectada na vacina; para minimizar eventos adversos pode-se usar a produção acelular dessa vacina

A vacina acelulares são preparadas de sobrenadantes da cultura livre de células obtidos através de filtração ou ultracentrífugas, Há abordagens distintas, em que diferentes componentes são purificados individualmente.
A toxina é então destoxificada com agentes químicos como formaldeído

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Vacinas Polissacarídicas

A vacina polissacarídeo bacteriana consiste em uma fermentação seguida de etapa de purificação, considerando as características inerentes de cada microrganismo. Esses antígenos são utilizados na formulação de vacinas polissacarídeos ou vacinas conjugadas.
É importante essas cepas produzirem polissacarídeos de forma eficiente e seguras.

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Vacinas Polissacarídeos meningocócicos

Essa vacina utiliza antígenos subcapsulares
O meio para produção de polissacarídeos meningocócicos em escala industrial é o sintético de Franz suplementado com 2 g/L de extrato de levedura dialisado;
A composição desse meio também utiliza vitamina B12 sulfato férrico e cloreto de amônio para o soro grupo A e W135. Uma característica desse meio é o pH entre 6,5 a 7
A fermentação tem início com a bactéria liofilizada ou congelada a -70ºC; as placas são incubadas por 16 a 18h a 37ºc em atmosfera contendo gás carbônico

O inóculo é transferido por frascos de 2L com 500 ml de meio; esses são transferidos para biorreatores de 150L com 90L de meio e o tempo de cultivo passa a ser 16 horas.
O tempo de cultivo é de extrema importância;
O perfil cinético mostra que esse cultivo está ligado à concentração de oxigênio o que possibilita o crescimento do microrganismo.

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Figura 4- Fluxograma produção de polissacarídeo meningocócicos

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Vacinas Conjugadas

Essa vacina tem o intuído de melhorar a natureza da resposta imunológica;
A principal alteração do processo é a conjunção química de polissacarídeos capsulares bacterianos com proteínas carreadoras;
Essa combinação resulta em moléculas altamente imunogênica em crianças, capazes de induzir memória imunológica; a primeira foi a vacina Hib onde usou-se antígeno polissacarídeo sintético conjugada à anatoxina tetânica.
Os polissacarídeos produzidos , controlados e liberados para a produção das vacinas
A Figura 4- mostra o fluxograma de processo de produção de vacinas conjugadas, mostrando os métodos químicos mais utilizados

Figura 4- Fluxograma geral do processo de produção da vacina conjugada

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Vacinas Virais para Humanos

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PRODUÇÃO DE VACINAS VIRAIS

Cultivo dos vírus em células animais (in vitro)

Cultura de células animais (MRC5)

Concentrado viral

Células infectadas

Colheita

Purificação do vírus

Distribuição e congelamento

VÍRUS PURIFICADO

A reprodução do vírus necessário para o preparo das vacinas, é realizado em cultivos ‘in vitro’ de células animais. Esses cultivos normalmente ocorrem sem agitação, em monocamadas ou em mais de uma camada de células, ate que toda a superfície da garrafa fique coberta. Em um momento adequado do cultivo, as células são inoculadas com os vírus apropriado, que rapidamente se propagem no interior delas. Após tratamento adequado o vírus é separado, purificado, inativado ou não, para dar origem a vacina.

O cultivo tb pode ocorrer em condições ditas homogêneas, submersas ou em suspensão. Onde as células se reproduzem sob contante agitação do meio, em biorreatores.

O cultivo submerso tem grandes vantagens em relação ao cultivo estático, pois diminui a chance contaminação devido as frequentes operações de inoculações dos frascos, trocas de meios... Seria usado uma dorna com cultivo submerso, que substituiria varias garrafas e iria reduzir a mão de obra.

Mas o cultivo submerso traria algumas desvantagens: é difícil obter uma suspensão de células animais individuais, elas não se multiplicam livremente em suspensão , precisam estar fixas em uma superfície sólida.

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Células animais

Vero

BHK 21

MDCK

Culturas primárias

Isoladas

VANTAGENS

São altamente estáveis;
Capacidade de multiplicação ou propagação “in vitro”;
Linhagens suscetíveis a infecção por diversos vírus.

MDBK

CHO

HELA

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Produção da vacina contra Influenza

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Ovos embrionados

5 º Dia- infecção viral

Remoção sobrenadante

Mais pura

VANTAGENS

São mais puras
Menos eventos adversos

Células Vero

É coletado após 4 dias

Produção da vacina Febre amarela

Figura 7- Crescimento celular e produção de vírus a partir de cultivo de células vero

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VACINAS COMBINADAS

As vacinas combinadas são de grande interesse com a perspectiva de prevenção de várias doenças ao mesmo tempo. Diminuem o número de visitas ao posto de saúde e o custo na vacinação Ex: Vacina dTpa – Tríplice Bacteriana Acelular

Contém Difteria, Tétano, Coqueluche

A Vacina Tríplice Viral é uma das vacinas obrigatórias na primeira infância e protege contra o sarampo, rubéola e caxumba, doenças contagiosas e possivelmente fatais.

Vacinas recombinantes – atuam como uma infecção natural, portanto são especialmente boas em ensinar ao sistema imunológico como combater os germes.

As vacinas recombinantes são também desenvolvidas a partir de partículas protéicas virais, só que não mais retiradas do plasma de pacientes, mas produzidas por leveduras engenheiradas, nas quais são introduzidas as seqüências de DNA correspondentes às seqüências gênicas do vírus, a partir das suas proteínas de superfície. Segundo Granovski, entre os diferentes microorganismos, a levedura, originada da massa do pão, é o mais adequado para a obtenção do antígeno de superfície da hepatite B, na produção da vacina recombinante.

�As leveduras portadoras da seqüência gênica do vírus são cultivadas em fermentadores, explica a pesquisadora Luzia Mitie Ioshimoto, membro da equipe. Com a fermentação, elas se multiplicam. Depois, a biomassa celular obtida é quebrada para a liberação do antígeno e passa por um processo de purificação. “Após várias etapas de purificação através de processos de alta tecnologia, como centrifugações diferenciais e em gradiente, cromatografia de adsorção e afinidade e ultrafiltração, é obtido um produto livre de contaminantes provenientes do levedo (proteínas, DNA e carboidratos)”, diz Luzia. Esse produto, que tem a mesma proteína de superfície do vírus, é a vacina, que irá ativar a produção de anticorpos.

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FUTURO DAS VACINAS

VACINAS DE DNA- fragmentos de DNA contendo os genes da doença- resposta celular imediata

VACINAS Terapêuticas- tratamento antiviral, suporte parcial a terapia efetiva- auxiliam na resposta T contra antígenos virais

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FUTURO DAS VACINAS

VACINAS DE DNA

A produção de vacina era feita por meio de partículas virais isoladas e purificadas do plasma de pacientes com infecção crônica pelo vírus.

Adaptado www. pontobiologia.com.br

As vacinas de DNA ou vacinas gênicas não são baseadas no próprio patógeno, como as vacinas atenuadas ou inativadas e sim, na informação genética do mesmo. Dessa forma, essa informação genética codifica uma ou mais proteínas do organismo patogênico, utilizando a maquinaria do próprio hospedeiro. Essas proteínas são denominadas antígenos e irão ativar o sistema imunológico do receptor da vacina, levando à produção de anticorpos, de células citotóxicas e de células de memória

As vantagens das vacinas de DNA, em relação aos outros métodos mais clássicos, incluem: a rápida produção, a possibilidade de adaptação a patógenos emergentes, a alta estabilidade à temperatura ambiente (devido à grande estabilidade da molécula de DNA) e a ativação das respostas humoral e celular do hospedeiro.

Como principal desvantagem, temos a baixa imunogenicidade destas vacinas (ou seja, elas não estão sendo tão eficientes em ativar a resposta imunológica do hospedeiro) em testes com animais de grande porte e em humanos, diferente do que vem sendo observado nos testes com roedores.

Vacinas de DNA– são fáceis e baratas para desenvolver e produzir um forte e longo imunidade duradoura

A administração da vacina pode ser com seringa, via intramuscular, ou pelo sistema gene gun, que consiste no disparo sobre a pele de microesferas metálicas recobertas com os plasmídeos modicados. Uma vez na célula, o gene é expresso no plasmídeo.

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VACINOLOGIA REVERSA

As vacinologia reversa utiliza a análise do genoma para identificar todos os antígenos que são expostos a superfície das células e antigenicamente conservados. Ex. Meningocócica do soro grupo B. Essa vacina possui três proteínas recombinantes fHbp-proteína ligante fator H, proteína Nad A-adesina

TECNOLOGIA DE ACOPLAMENTO DE GLICANOS A PROTEÍNAS: plataforma que representa uma evolução do processo de produção da vacina conjugadas utilizando métodos químicos; permite conjugação biológica de açúcares bacterianos

Vacinas recombinantes – atuam como uma infecção natural, portanto são especialmente boas em ensinar ao sistema imunológico como combater os germes.

As vacinas recombinantes são também desenvolvidas a partir de partículas protéicas virais, só que não mais retiradas do plasma de pacientes, mas produzidas por leveduras engenheiradas, nas quais são introduzidas as seqüências de DNA correspondentes às seqüências gênicas do vírus, a partir das suas proteínas de superfície. Segundo Granovski, entre os diferentes microorganismos, a levedura, originada da massa do pão, é o mais adequado para a obtenção do antígeno de superfície da hepatite B, na produção da vacina recombinante.

�As leveduras portadoras da seqüência gênica do vírus são cultivadas em fermentadores, explica a pesquisadora Luzia Mitie Ioshimoto, membro da equipe. Com a fermentação, elas se multiplicam. Depois, a biomassa celular obtida é quebrada para a liberação do antígeno e passa por um processo de purificação. “Após várias etapas de purificação através de processos de alta tecnologia, como centrifugações diferenciais e em gradiente, cromatografia de adsorção e afinidade e ultrafiltração, é obtido um produto livre de contaminantes provenientes do levedo (proteínas, DNA e carboidratos)”, diz Luzia. Esse produto, que tem a mesma proteína de superfície do vírus, é a vacina, que irá ativar a produção de anticorpos.