Саяпина Н.В.,Ладыгин С.С., Бушмелев С.И.
ВВЕДЕНИЕ.
Криоконсервация эмбрионов методом витрификации обеспечивает высокую выживаемость бластоцист человека, увеличивая частоту наступления беременности и снижение количества свежих циклов для пациентов (Loutradi K. E. et al., 2009; Wolkers, W. F. et al., 2015; Allen, M. et al., 2022; Vajta, G et al., 2006). Ключевым вопросом использования методик криоконсервации является проблема кристаллизации воды с возникновением негативных физико-химических явлений способных повреждать клетки эмбрионов. (Jin, B. et al., 2015; Wolkers, W. F. et al., 2015; Seki, S. et al., 2012; Allen, M. et al., 2022).
ЦЕЛЬ. Изучить влияние экспозиции на воздухе при комнатной температуре (23–25°C) в течение определенного времени (от 5 сек до 60 сек), на реэкспансию анеуплоидных эмбрионов человека 5–6 суток развития, криоконсервированных методом витрификации.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
Процент реэкспансии эмбрионов в контрольной группе составил 90 %, в опытных группах наблюдалось колебание показателя от 90% до 30% .
Рис.1.Эмбрионы через 24 часа при экспозиции в 40 секунд.
ВЫВОДЫ.
Витрифицированные эмбрионы обладают определенной устойчивостью к температурным и временным колебаниям в процессе разморозки. Отсутствие тренда на планомерное снижение реэкспансии эмбрионов 5-6 суток развития указывает на широкий диапазон допустимой выдержки без значимого ущерба для эмбрионов.
Результаты показывают, что выдержка на воздухе перед погружением в первый раствор для размораживания не оказывает абсолютного негативного влияния на реэкспансию анеуплоидных эмбрионов. Разницу между контрольной и опытной группой №4 (p=0.08), можно интерпретировать как "тенденцию к различиям". Следовательно, требуется больше данных для получения надежных выводов. Необходимо дальнейшее изучение оценки влияния возможного стресса, испытываемого эмбрионами при нахождении на воздухе перед погружением в первый раствор для разморозки на экспрессию ключевых имплантационных генов. Также, использование только анеуплоидных эмбрионов ограничивает экстраполяцию результатов на эуплоидные. Рекомендуется дальнейшее изучение протокола на эуплоидных эмбрионах с увеличением выборки и с последующей оценкой клинических исходов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
В исследовании использовалось 80 анеуплоидных эмбрионов человека на стадии бластоцисты (5–6 суток развития). По классификации Gardner (Gardner, D.K. et al., 1999) с акцентом на высокое качество внутренней клеточной массы (ICM) и трофэктодермы (TE). Распределение по морфологическому качеству до замораживания: АА (n=15), АВ (n=24), ВА (n=13), ВВ(n=28). Все эмбрионы были заморожены методом витрификации с применением наборов Kitazato VT601 и Протеинсинтез B-VIT. Крионосители: Cryotop (Kitazato) и Vitrifit (Origio). Размораживание проводилось с использованием набора Kitazato VT602. В исследовании сравнивались стандартный протокол разморозки (Kitazato VT602) и модифицированные (с выдержкой на воздухе). В качестве оценки выживаемости определялась реэкспансия эмбрионов через 24 часа после оттаивания. После разморозки эмбрионы культивировались в 0,5 мл одноэтапной среды G-TL (Vitrolife) в условиях пониженного кислорода (6% CO₂, 5% O₂) в 4-луночных планшетах Nunc покрытых 0,5 мл маслом Ovoil (Vitrolife) в инкубаторе Planer Origio. Оценка эмбрионов выполнялась с помощью инвертированного микроскопа (Nikon Eclipse Ti). Полученные количественные данные опытных групп подвергались статистическому сравнению с контрольной группой с помощью точного критерия Фишера. Уровень статистической значимости (p < 0,05).
Статистически значимое снижение на 67% зафиксировано только в группе №7 с выдержкой на воздухе 60 секунд. В остальных опытных группах не отмечались статистически значимые отличия от контрольной группы. Также не зафиксирована тенденция закономерного снижения показателя реэкспансии при увеличении времени экспозиции на воздухе.
Табл.1. Показатели реэкспансии
Влияние модифицированного протокола размораживания на реэкспансию эмбрионов человека 5–6 суток развития.