1

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РФ

ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского»

Институт биохимических технологий, экологии и фармации

  Кафедра физиологии человека и животных и биофизики

�

Создание нутрицевтических препаратов на основе вторичных метаболитов мирта обыкновенного (Myrtus communis L.): экспериментальные исследования

Заведующая кафедрой физиологии

человека и животных,

и биофизики, д.б.н., профессор

Чуян Е. Н.

Симферополь, 2025

2

 Кафедра физиологии человека и животных и биофизики

Биоскрининг новосинтезированных химических соединений и веществ растительного происхождения

Биоскрининг новосинтезированных химических соединений и веществ растительного происхождения

• Целью этих исследований является выявление биологической эффективности новосинтезированных химических веществ и природных соединений, сравнение с эталонными лекарственными средствами (референс-препаратами), исследование их токсичности, безопасности, механизмов действия на функциональное состояние организма, в том числе в модельных экспериментах in vitro и in vivo – острый и хронический стресс, боль, воспаление, ишемия, инфаркт миокарда, сахарный диабет.
• биологический скрининг химических соединений – кандидатов в лекарственные вещества (совместная работа с сотрудниками кафедр органической и неорганической химии ИБТЭФ, Кубанским медуниверситетом, Новосибирским институтом неорганической химии и др.)
• фито- и биосредств (пробиотики, микробные симбиотические продукты, экстракты грибов и растений, энтеросорбенты на основе растительного сырья).

​

3

4

ЦЕНТР КОЛЛЕКТИВНОГО ПОЛЬЗОВАНИЯ (ЦКП) 

НАУЧНЫМ ОБОРУДОВАНИЕМ�"ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ И БИОФИЗИКА"

​

Создан Приказом ФГАОУ ВО «КФУ имени В.И. Вернадского» №448 от 08.06.2017 г.

сайт Научно-технологической инфраструктуры Российской Федерации http://www.ckp-rf.ru/ckp/507980//

5

Этологические исследования

6

Исследование нейронной активности

Клиническая лабораторная диагностика биоматериалов животных и человека

7

• иммуноферментный анализ биологических жидкостей;
• мультиплексный анализ биомаркёров в сыворотке крови;
• спектрофотометрический анализ биологических проб и образцов;
• анализ биохимических показателей крови;
• общий анализ крови.

Лаборатория экспериментальной физиологии

8

Основные процессы создания нутрицевтических препаратов ��.

Основные процессы создания нутрицевтических препаратов ��.

Создание нутрицевтических препаратов на основе вторичных метаболитов мирта

• В настоящее время сырье мирта обыкновенного (Myrtus communis L.), лекарственного растения семейства Myrtaceae Juss, не зарегистрировано в Российской фармакопее как лекарственное, отсутствуют стандартизированные методики качественного и количественного определения БАВ мирта, которые представлены различными группами вторичных метаболитов: фенольными кислотами, флавоноидами, растворимыми танинами, эфирными маслами, аминокислотами, эссенциальными элементами, с чем связан широкий спектр потенциальной фармацевтической активности этого растения. Достаточно широкий диапазон терапевтических возможностей (антибактериальное, антиоксидантое, седативное, антигипергликемическое, противовоспалительное, гипотензивное, противоязвенное, антидиарейное действие и др.) в сочетании с низкой токсичностью создает перспективу для разработки различных фармацевтических субстанций на основе сырья этого растения.

​

11

Создание нутрицевтических препаратов на основе вторичных метаболитов мирта

• В ФГБУН «Ордена Трудового Красного Знамени Никитский ботанический сад – Национальный научный центр РАН» создан высокопродуктивный и морозоустойчивый сорт мирта обыкновенного, разработана технология размножения растений вегетативным способом для создания промышленных сырьевых плантаций, что позволяет получить однородное сырье высокого качества со стабильными характеристиками.
• Установлено, что биохимический состав сырья зависит от условий выращивания растений, в том числе почвенно-климатических условий возделывания культуры, инсоляции и пр.

12

• При выращивании на Южном берегу Крыма (северная граница естественного ареала мирта) в условиях сухого субтропического климата средиземноморского типа сырье мирта характеризуется высоким содержанием фенольных соединений, флавоноидов. В листьях мирта накапливается до 0.82% эфирного масла на абсолютно сухую массу, что почти в два раза больше, чем в сырье других регионов. Высокое содержание именно этих компонентов обусловливает высокие фармацевтические свойства сырья мирта, выращенного в условиях Южного берега Крыма (Bakova E.Yu. Et all., 2019).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ �

• Объект исследования – фармацевтические субстанции: два вида экстрактов (водный и спиртовой) и гидролат мирта, изготовленные в ФГБУН «НБС-ННЦ» (Бакова Н.Н., Бакова Е.Ю., Шевчук О.М.) из высушенных листьев мирта (Myrtus communis L.), собранных в период плодоношения растения и предоставленные для биоскрининга.

Экстракцию сырья и приготовление экстрактов проводили в соответствии с методом, описанным в Государственной фармакопее РФ ХIII:

• образец I - водный экстракт (сироп 1);
• образец II - водно-этанольный экстракт (сироп 2);
• образец III - гидролат мирта получали методом паровой отгонки, которую выполняли по методу Далматова.

13

14

Компонентный состав тестируемых образцов

Исследование качественного состава фенольного комплекса проводили с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии согласно ОФС1.2. 1.2.0005.15. Компонентный состав летучих соединений гидролата определяли с помощью аппаратно-программного комплекса на базе хроматографа «Хроматек-Кристалл 5000.2», оснащенного масс-спектрометрическим детектором.

15

• Экспериментальная часть работы выполнена в Центре коллективного пользования научным оборудованием «Экспериментальная физиология и биофизика» кафедры физиологии человека и животных и биофизики ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского».
• Исследования выполняли:
• профессор Чуян Е.Н.
• доцент Миронюк И.С.
• доцент Раваева М.Ю.
• доцент Черетаев И.В.
• аспиранты и студенты.

​

• Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ, принципам Базельской декларации и рекомендациям этического комитета по биоэтике ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского» (протокол № 5 от 2022 г.).

Материалы и методы исследования

16

Цель: выявление биологической активности образцов вторичных метаболитов мирта при их многократном введении (21 день) крысам.

​

Задачи:

1. исследовать динамику показателей кожной микроциркуляции и артериального давления у здоровых крыс под влиянием многократного введения образцов вторичных метаболитов мирта;
2. установить изменения показателей микроциркуляции крыс в постишемическом периоде при длительном введении вторичных метаболитов мирта;
3. исследовать изменения поведенческих реакций крыс при введении образцов вторичных метаболитов мирта;
4. исследовать изменения гистологических показателей внутренних органов крыс под влиянием многократного введения образцов вторичных метаболитов мирта;
5. провести сравнительный анализ биологической активности образцов вторичных метаболитов мирта.

​

Цель и задачи исследования

Динамика показателей кожной микроциркуляции и артериального давления у здоровых крыс под влиянием многократного введения образцов вторичных метаболитов мирта

18

Организация эксперимента

Введение образцов осуществлялось внутрижелудочным зондом �(ООО «МИЗ-ТУМБОТИНО» Медико-инструментальный завод Тумботино).

19

Методика регистрации показателей кожной микроциркуляции у лабораторных крыс

Расположение ритмических колебаний микрокровотока

Схема зондирования ткани лазерным излучением световодного зонда анализатора ЛАЗМА-МЦ

20

Показатель перфузии:

ПП = Nэр*Vср,

где Nэр – количество эритроцитов в зондируемом объеме, Vср – средняя скорость эритроцитов.

СКО (σ) – среднее квадратичное отклонение (перф.ед.)

Коэффициент вариации:

Kв = σ / ПП*100%,

Неосцилляторные показатели

Исследуемые показатели кожной микроциркуляции

Пример ЛДФ-граммы микрокровотока крысы в программе LDF 2.20.0.507WL

(Неосцилляторные показатели)

21

Исследуемые показатели кожной микроциркуляции

Нормирование амплитуд:

Анорм = А/3σ,

где А – амплитуда колебаний в диапазоне от 0,02 – 2 Гц, σ – среднее квадратичное отклонение.

Осцилляторные показатели

Нейрогенный (миогенный) тонус:

НТ (МТ) = σ*АДср / Ан(Ам)*ПП.

Среднее артериальное давление:

АДср = ДАД + 1/3(САД – ДАД),

где ДАД – диастолическое артериальное давление, САД – систолическое артериальное давление.

Приток:

ΣАmax = Аэ + Ан + Ам + Ас.

Cоотношение притока крови к венозному оттоку:

С = ΣАmax / Ад.

22

Динамика амплитуд колебаний и показателя перфузии у крыс после введения тестируемых образцов относительно значений в контрольной группе животных, принятых за 100%

Аэ – амплитуда эндотелиальных колебаний;

Ан – амплитуда нейрогенных колебаний;

Ам – амплитуда миогенных колебаний;

ПП – показатель перфузии.

* – уровень достоверности различий относительно значений показателей в контрольной группе животных;

# – уровень достоверности различий между значениями показателей у крыс 2 и 3 группы.

23

Динамика артериального давления и тонусов микрососудов у крыс после введения тестируемых образцов относительно значений в контрольной группе животных, принятых за 100%

САД – систолическое артериальное давление;

ДАД – диастолическое артериальное давление;

НТ – нейрогенный тонус;

МТ – миогенный тонус.

* – уровень достоверности различий относительно значений показателей в контрольной группе животных;

# – уровень достоверности различий между значениями показателей у крыс 2 и 3 группы.

24

Динамика притока и соотношения притока крови к венозному оттоку у крыс после введения тестируемых образцов относительно значений в контрольной группе животных, принятых за 100%

* – уровень достоверности различий относительно значений показателей в контрольной группе животных.

– приток

– соотношение притока крови к венозному оттоку

25

• Вазотропная активность образцов I и II зависела от продолжительности их введения животным: в первые сутки наблюдения реакция микрососудов кожи крыс на их введение заключалась в уменьшении тонуса прекапилляров, вазодилатации и снижении артериального давления; после 7-кратного введения образца I и 14-кратного введения образца II развивалась противоположная реакция, характеризующаяся вазоконстрикцией микрососудов и увеличением артериального давления; при более продолжительном применении (14 – 21 сутки) вазоконстрикторные реакции ослабевали и значения показателей микроциркуляции и артериального давления приближались к уровню контрольных значений, т.е. к физиологической норме.
• Выраженность вазотропных эффектов образцов I и II значительно отличалась в зависимости от их состава: при однократном введении образца II крысам вазодилатация более выраженная, что сопровождается достоверными различиями между значениями показателей микроциркуляции у крыс 2 и 3 группы; вазоконстрикция наблюдалась в разные сроки эксперимента, а именно на 7 сутки после введения образца I и на 14 сутки после введения образца II; вазоконстрикция сопровождалась достоверным повышением артериального давления только при введении образца I; ослабевание вазоконстрикции и развитие адаптивных реакций у крыс 2 и 3 группы отмечено в разные сроки эксперимента, а именно на 14 и 21 сутки после введения образцов I и II соответственно.

Вазотропная активность вторичных метаболитов мирта

Показатели микроциркуляции крыс�в постишемическом периоде при введении различных композиций вторичных метаболитов мирта�

Методика проведения эксперимента�

• Для проведения эксперимента были сформированы группы:

​

1. Группа «Ишемия контроль» – 6 особей, перенесших смоделированную ишемическую атаку, без дальнейшего фармакологического разрешения инсульта.
2. Группа «Ложно оперированные»- 4 особи, которым не проводилось моделирование ишемии.
3. Группа «Гидролат» – 6 особей, которым была смоделирована ишемия головного мозга с последующими введениями гидролата мирта в объёме 0,5 мл в течении 21 суток.
4. Группа «Сироп I» – 6 крыс, перенесших смоделированную ишемическую атаку путем окклюзии левой общей сонной артерии с последующим введением сиропа I мирта в объёме 0,5 мл в течении 21 суток.
5. Группа «Сироп II» – 6 особей, которые перенесли ишемию, с последующим введением Сироп II мирта в объёме 0,5 мл в течении 21 суток.

​

27

Моделирование ишемии

28

Введение в телазол-медитиновый наркоз внутримышечной инъекцией

Обездвиживание животного на операционном столе

Надрез поверхностного слоя тканей шейной зоны

Отделение ветви парной общей сонной артерии

Наложение клипсы на ветвь парной общей сонной артерии

Снятие клипсы

Восстановление целостности тканей

Обработка послеоперационного шва

29

Методика регистрации микроциркуляции

Микроциркуляцию регистрировали с помощью тактильного датчика лазерного анализатора кровотока «ЛАЗМА-МЦ1» (НПП «Лазма», Россия), который накладывался на бульбарную конъюнктиву глаза крысы.

​

Аппаратно-программный комплекс «ЛАЗМА МЦ-1»

Наложение датчика на бульбарную конъюнктиву глаза крысы

Показатели микроциркуляции группы «Ишемия контроль» по сравнению с ложно оперированной группой

30

Примечание: Аэ – эндотелиальные колебания; Ан – нейрогенные колебания; Ам – миогенные колебания; звездочками отмечены достоверные различия по отношению к ложно оперированной группе (Л/О) при * р< 0,05 по критерию Манна-Уитни.

Показатели микроциркуляции группы «Ишемия контроль» по сравнению с ложно оперированной группой

31

Примечание: Ад – дыхательные колебания; Ас – пульсовые колебания; ПМ – показатель перфузии; звездочками отмечены достоверные различия по отношению к ложно оперированной группе (Л/О) при * р< 0,05 по критерию Манна-Уитни.

​

​

32

Сироп II

Сравнительный анализ показателя перфузии у крыс относительно группы «Ишемия контроль»

​

33

Сравнительный анализ амплитуд эндотелиальных колебаний

1. При ишемии-реперфузии головного мозга на 30 минуте происходило достоверное снижение показателей микроциркуляции, которые сохранялись на протяжении всего постишемического периода.
2. При применении гидролата мирта основные эффекты реализовывались на 1-е сутки. К 20-м суткам показатели микроциркуляции не превышали таковые в группе «Ишемия», что свидетельствует об отсутствии корригирующего влияния гидролата мирта при длительном его применении.
3. Применение сиропа мирта I приводило к увеличению микроциркуляции у крыс в постишемическом периоде начиная с 5-х суток постишемического периода в основном за счет увеличения метаболической активности эндотелия, связанной с релизингом оксида азота.
4. Корригирующее действие сиропа мирта II имеет кратковременный эффект в первые 5 суток противоишемического периода. В последующие сутки достоверных изменений микроциркуляции не наблюдалось.
5. Сравнительный анализ действия вторичных метаболитов мирта на микроциркуляцию крыс после ишемии-реперфузии показал, что наиболее эффективно проявил себя сироп мирта I, так как уже на 5-е сутки заметно улучшение результатов, которое сохраняется до 15 суток постишемического периода. Сироп мирта II и гидролат мирта оказывали кратковременное действие, развивающееся в течение первых пяти суток постишемического периода.

​

​

34

Изменение поведенческих реакций крыс при введении композиций вторичных метаболитов мирта�

Методы оценки влияния образцов вторичных метаболитов мирта на поведенческие реакции крыс

36

тест «открытое поле» -

актиметр (IR Actimeter, Pan Lab Harvard Apparatus» Испания) с двумя ИК рамками – датчиками движений

тест «крестообразный

приподнятый лабиринт»

Эффекты влияния гидролата мирта и сиропа мирта на поведенческие реакции крыс в тесте «открытое поле»�

37

Эффекты влияния гидролата мирта и сиропа мирта на поведенческие реакции крыс в тесте «КПЛ»�

38

• Под влиянием гидролата и сиропа мирта наблюдалось существенное изменение некоторых показателей поведенческих реакций крыс в тестах «открытое поле» и «крестообразный приподнятый лабиринт», что свидетельствует о снижении уровня тревожности животных.
• Следовательно, гидролат и сироп мирта обладают анксиолитической активностью, причем гидролат мирта обладает более выраженным эффектом.

​

39

Влияние композиций вторичных метаболитов мирта на гистологические показатели внутренних органов крыс�

ДИЗАЙН ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

41

42

Методика проведения гистологического анализа показателей

слизистой оболочки желудка крыс

Фрагмент тела (А) и пищеводной части (Б) желудка крысы контрольной группы. Окраска гематоксилином и эозином. Объектив 10х и 40х

​

Примечания – CO - слизистая оболочка; ПЭ - покровный эпителий; О - обкладочные клетки; Г - главные клетки

Внешний вид микроволнового гистологического процессора LOGOS для гистологической обработки тканей (А) и сканера гистопрепаратов Aperio CS2 (Б)

Морфометрические характеристики тканевых структур гистологических препаратов

(система визуального анализа, программа Image J

43

Методика проведения гистологического анализа показателей печени крыс

Микрофотография печени крыс контрольной группы.

Гематоксилин-эозин. Объектив 10х и 40х. Масштабная линейка 100 и 400 мкм

​

Внешний вид микроволнового гистологического процессора LOGOS для гистологической обработки тканей (А) и сканера гистопрепаратов Aperio CS2 (Б)

44

Метод проведения гистологического анализа

показателей почек крыс

Микрофотография элементов нефрона крыс контрольной группы

45

Изменения толщины слизистой оболочки и плоского эпителия пищеводной части желудка у крыс контрольной и экспериментальных групп

Слизистая пищеводной части желудка крыс контрольной группы (А) и после 21-кратного введения Образца I (Гидролат, Б), Образца II (Сироп 1, В), Образца III (Сироп 2, Г)

Гематоксилин-эозин

Масштабная линейка 100 мкм. Объектив 40х

Примечания: * – уровень достоверности различий относительно значений показателей в контрольной группе животных по критерию Краскела-Уоллиса;

# – уровень достоверности различий значений показателей в группе 4 относительно значений показателей в группе 2 по критерию Краскела-Уоллиса.

.

Б

В

Г

Примечания: 1 - плоский эпителий, 2 - зернистый слой 3 - шиповатый слой, 4 -базальный слой.

46

Изменение клеточного состава слизистой оболочки желудка у крыс контрольной и экспериментальных групп

Примечания: * – уровень достоверности различий относительно значений показателей в контрольной группе животных по критерию Краскела-Уоллиса; p<0,01

.

Примечания: 1 - плоский эпителий, 2 - зернистый слой 3 - шиповатый слой, 4 -базальный слой.

Слизистая оболочка тела желудка у крыс контрольной группы (А), после 21-кратного введения Образца I (Б),

Образца II (В), Образца III (Г)

Гематоксилин-эозин. Объектив 40х

А

Г

В

Б

47

Изменение площади долек печени у крыс контрольной и экспериментальных групп

Примечания: * – уровень достоверности различий относительно значений показателей в контрольной группе животных по критерию Краскела-Уоллиса;

# – уровень достоверности различий значений показателей в группе 4 относительно значений показателей в группе 2 по критерию Краскела-Уоллиса.

Микрофотография печени крыс контрольной группы (а) и крыс, получавших Образец I (б), Образец II (в), Образец III (г). Гематоксилин-эозин. Объектив 40х

Микрофотография печени крыс контрольной группы (а) и крыс, получавших Образец I (б), Образец II (в), Образец III (г). Гематоксилин-эозин. Объектив 40х

Изменение относительной площади паренхимы периферической и центральной частей дольки печени у крыс контрольной и экспериментальных групп

Примечания: * – уровень достоверности различий относительно значений показателей в контрольной группе животных по критерию Краскела-Уоллиса;

# – уровень достоверности различий значений показателей в группе 4 относительно значений показателей в группе 2 по критерию Краскела-Уоллиса.

49

Результаты гистологического анализа почек у крыс контрольной и экспериментальных групп

Микрофотография элементов нефрона крыс контрольной группы (А) и крыс, получавших Образец I (Б), Образец II (В), Образец III (Г). Гематоксилин-эозин. Объектив 40х

​

Изменение высоты эпителиоцитов проксимальных и дистальных извитых канальцев нефрона у крыс контрольной группы и крыс после 21-кратного введения вторичных метаболитов мирта

Примечания: * – уровень достоверности различий относительно значений показателей в контрольной группе животных по критерию Краскела-Уоллиса;

# – уровень достоверности различий значений показателей в группе 4 относительно значений показателей в группе 2 по критерию Краскела-Уоллиса.

50

​

​

Многократное введение вторичных метаболитов мирта (21 день) вызвало изменение морфометрических показателей слизистой оболочки желудка, печени и почек, однако эти изменения не выходили за пределы нормы и не сопровождались нарушением функции, что свидетельствует об адаптации организма животных к исследуемым фармакологическим субстанциям.

​