ЛЕКЦІЯ 2 �СИСТЕМАТИКА МІКРООРГАНІЗМІВ�
1
2
Дерево життя Ернста Геккеля у Generelle Morphologie der Organismen (1866)
Основним завданням систематики є побудова філогенетичної системи усіх організмів, що відображає хід еволюції. Першу спробу зобразити еволюційну історію всіх живих організмів зробив Ернст Геккель у 1866 році незабаром після того, як Дарвін опублікував «Походження видів» (1859). Геккель запропонував схему, в якій чотири основні групи організмів (Plantae, Animalia, Protista та Moneres) еволюціонували від загального одноклітинного предка. У групу Moneres (Монера) Геккель включав усі мікроорганізми
3
Універсальне дерево життя Роберта Віттекера (1969)
У 1969 році Роберт Віттекер запропонував систему живої природи з п’яти царств, яка демонструє певний прогрес у розумінні мікробної еволюції з часів Геккеля. Віттекер визнав ті самі групи що і Геккель, та вперше запропонував виділити Fungi (Гриби) як окреме царство. Протисти, як і у Геккеля, включали еукаріотичні мікроорганізми, а Монера, відповідно, - прокаріотичні мікроорганізми.
4
У 1970-х роках Карл Возе запропонував використовувати для з’ясування родинних тобто еволюційних зв’язків між організмами порівняння послідовностей нуклеотидів генів, що кодують рРНК. Універсальне дерево життя, побудоване на основі послідовностей генів рРНК, це сучасне уявлення про генеалогію всього живого на Землі. Ця діаграма зображує історію еволюції — філогенез усіх організмів і чітко формує три домени. Корінь універсального дерева являє собою момент часу, коли все існуюче життя на Землі мало останнього універсального спільного предка (Last Universal Common Ancestor) LUCA. Від LUCA еволюція йшла двома шляхами до формування доменів Bacteria та Archaea.
Філогенетичне дерево життя, засноване на порівнянні 16(18)S рРНК (Woese, C.R. et al., doi.org/10.1073/pnas.87.12.4576). В корені дерева позначено LUCA - останній універсальний спільний предок.
5
Пізніше домен Archaea розійшовся з доменом Eucarya. Ці три домени клітинного життя Bacteria, Archaea та Eucarya є еволюційно різними, але вони мають спільні риси, що вказують на їх спільне походження від універсального клітинного предка. У кожному домені у ході еволюції формувалися нові ієрархічні групи – таксони, які представляють сучасний зріз сформованої та існуючої біологічної різноманітності живих організмів, у тому числі і мікроорганізмів.
Для впорядкування величезної кількості форм клітинного життя призначена наука систематика. В подальшому у цьому розділі буде наведено основні положення систематики прокаріотних мікроорганізмів.
Систематика це біологічна наука, яка вивчає різноманітність організмів, поділ їх на групи (таксони), родинні зв’язки між ними та визначає правила найменувань організмів. Завданням систематики мікроорганізмів є впорядкування великих масивів даних про мікробіологічні об’єкти для зручної роботи з ними.
6
7
Оскільки мікроорганізми - це велика збірна група, в яку організми об'єднані виключно за мікроскопічними розмірами, то термін мікроорганізм не є таксономічним. До мікроорганізмів відносяться бактерії, археї, мікроскопічні гриби, мікроскопічні водорості, найпростіші, а також віруси, що не мають клітинної будови і використовують біосинтетичний апарат клітини хазяїна. Еукаріотні мікроорганізми - мікроскопічні водорості, мікроскопічні гриби, найпростіші, а також віруси є об’єктами, відповідно, ботаніки, зоології та вірусології, тому їх систематика розглядається в спеціалізованих розділах цих біологічних наук. У цій главі підручника розглядаються правила біологічної номенклатури та класифікація саме прокаріотних мікроорганізмів – бактерій та архей.
Оскільки мікроорганізми - це велика збірна група, в яку організми об'єднані виключно за мікроскопічними розмірами, то термін мікроорганізм не є таксономічним. До мікроорганізмів відносяться бактерії, археї, мікроскопічні гриби, мікроскопічні водорості, найпростіші, а також віруси, що не мають клітинної будови і використовують біосинтетичний апарат клітини хазяїна. Еукаріотні мікроорганізми - мікроскопічні водорості, мікроскопічні гриби, найпростіші, а також віруси є об’єктами, відповідно, ботаніки, зоології та вірусології, тому їх систематика розглядається в спеціалізованих розділах цих біологічних наук. У цій главі підручника розглядаються правила біологічної номенклатури та класифікація саме прокаріотних мікроорганізмів – бактерій та архей.
8
Мікроскопічні водорості
Мікроскопічні гриби
Найпростіші
Бактерії
Археї
9
Бібліотека Трініті-коледжу в Університеті Дубліна
��ТАКСОНОМІЯ��
поділ сукупності організмів на групи (таксони) та визначення їх підпорядкування (царство, відділ, клас, порядок, родина, рід, вид)
10
�Ієрархія таксонів�Латинські назви Українські назви�
11
Міжнародний кодекс номенклатури �прокаріот
12
Для впорядкування систематики прокаріот у 1980 році було прийнято Міжнародний кодекс номенклатури бактерій (прокаріот), який визначає правила найменування таксонів відповідно до їх рангу. Як такий він є одним із кодексів біологічної номенклатури. На базі визначених у ньому принципів була проведена інвентаризація назв прокаріотів і складено Затверджені Списки назв (Approved Lists) та почав видаватися Міжнародний журнал систематичної та еволюційної мікробіології. Міжнародна біологічна номенклатура прокаріот – це правила найменувань та списки затверджених назв таксонів.
�ПРИНЦИПИ КЛАСИФІКАЦІЇ ПРОКАРІОТ�
13
БІОЛОГІЧНА НОМЕНКЛАТУРА�
та список назв таксонів
14
�Правила найменування таксонів�Для назв таксонів використовується біологічна латинська мова, яка на час становлення систематики була мовою науки, як зараз англійська. У мікробіології як і взагалі в біології для назви виду у прокаріот використовують біномну систему (біномну номенклатуру). Назва виду складається з двох слів і включає назву роду та видове визначення, наприклад, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus. Назва штаму включає назву виду та штамове визначеня, яке дається у довільній формі: Escherichia coli АТСС 1095, Bacillus subtilis ІМВ 987, Pseudomonas aeruginosa ONU 10057. При частому написанні назва виду може скорочуватися - E. coli, B. subtilis, S. aureus. Назви інших таксонів вище виду складаються з одного слова. �Назва роду: Escherichia, Bacillus�Назва виду: Escherichia coli (скорочена назва E. coli)�Bacillus subtilis (скорочена назва B. subtilis)�Назва штаму: Escherichia coli АТСС 1095�Bacillus subtilis ІМВ 987�Pseudomonas aeruginosa ONU 10057� Приклади невірних скорочень назв виду!: Streptomyces griseus (Str. griseus); Bacillus subtilis (Bac. subtilis)
15
� Як і в ботаніці та зоології основною таксономічною одиницею у прокаріот є вид. � Визначення виду за Е. Майром – “група природних популяцій організмів, що схрещуються, або потенційно здатних до схрещування та репродуктивно ізольованих від інших таких груп” для прокаріот не підходить!� Визначення виду для прокаріот через їх генетичну мінливість та видову гетерогенність є неоднозначним.� В мікробіології вид може бути визначений як сукупність штамів з високим ступенем схожості послідовностей ДНК (для 16S рРНК більше 95%) та фенотипових ознак. � ����
16
17
Проблеми виду в мікробіології пов’язані з неможливістю визначення чітких меж між представниками споріднених видів, що обумовлено значною генетичною мінливістю прокаріотів завдяки наявності мобільних позахромосомних генетичних елементів (плазміди, транспозони, бактеріофаги) та механізмам горизонтального переносу генетичної інформації (кон’югація, трансдукція, трансформація) та перетасовування генів у геномі (генні касети).
�ВАЖЛИВІ МІКРОБІОЛОГІЧНІ ТЕРМІНИ��ШТАМ� - представник виду мікроорганізму, ізольований із певного джерела і в певний час.��БІОВАР �Для визначення внутрішньовидової різноманітності застосовують підвидову категорію біовар (біологічний варіант). Біовари як представники конкретного виду відрізняються за певними біологічними ознаками (хемовар, фаговар, серовар, резистенсвар і т.і.).�� КЛОН� – популяція клітин отримана із однієї клітини, що розмножилась.�� �
18
��КУЛЬТУРА�- популяція клітин мікроорганізму, що штучно вирощується (або виросла)�� КУЛЬТИВУВАННЯ �- процес штучного вирощування мікроорганізмів ��ЧИСТА КУЛЬТУРА�- популяція мікроорганізмів, що складається з клітин одного виду��КОЛОНІЯ� – ізольоване скупчення клітин, що утворилося на поверхні щільного поживного середовища�
19
Ідентифікація мікроорганізмів
визначення положення мікроорганізму в системі класифікації (визначення назви)
Діагностика мікроорганізмів
визначення відношення ізольованого мікроорганізму до певної групи збудників
20
�� Скорочене написання назв виду:� Escherichia coli - E.coli � Bacillus subtilis - B. subtilis � Pseudomonas aeruginosa – P.aeruginosa �� Невірні скорочення назв виду!:� Streptomyces griseus (Str. griseus)� Bacillus subtilis (Bac. subtilis)
21
Одною з головних задач систематики є побудова за визначеними правилами системи (схеми), в якій у певному порядку розташовуються представники мікроорганізмів, об’єднані в групи (таксони). Таку схему називають класифікацією.
КЛАСИФІКАЦІЯ це створена за певними правилами система живих організмів �
22
23
У залежності від підходів до побудови класифікації є штучними (фенотиповими), або природними (філогенетичними). В основу фенотипової класифікації прокаріот покладено визначення ступеня схожості за сукупністю їх фенотипових (морфо-культуральних і фізіолого-біохімічних) ознак.
Для класифікації прокаріот використовують сукупність морфологічних, фізіологічних, біохімічних. та молекулярно-біологічних характеристик та ознак: морфологію клітин і колоній за певних умов культивування; культуральні ознаки (характер росту на середовищах різного складу); фізіологічні характеристики (використання різних субстратів, відношення до температури, аерації, рН і т.і.); біохімічні властивості (наявність певних ферментів та метаболічних шляхів); молекулярно-біологічні характеристики (послідовність нуклеотидів 16S рРНК, вміст ГЦ-пар); хемотаксономічні ознаки (хімічний склад, наявність специфічних сполук); серологічні властивості (наявність певних антигенів); чутливість до специфічних фагів (фаготипування).
СУЧАСНІ ПІДХОДИ В СИСТЕМАТИЦІ��Кластерний аналіз �(Нумерична таксономія)��Хімічний аналіз �(Хемотаксономія)��Послідовність нуклеотидів�(Геносистематика)��
24
Кластерний аналіз
25
Нумерична таксономія
26
Хемотаксономія. Хімічні таксономічні маркери: компоненти клітинної стінки, ліпіди, компоненти електрон-транспортної системи, пігменти, послідовність амінокислот у білках.
27
Ступінь вмісту ГЦ-пар у ДНК
28
ГЕНОСИСТЕМАТИКА
або МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧНА СИСТЕМАТИКА
29
Гібридизація ДНК
30
Гібридизація in situ з флуоресцентною міткою FISH
31
32
Сучасна молекулярно-біологічна класифікація базується на визначенні ступеня родинних зав’язків, що передбачає аналіз послідовності консервативних молекул важливих біополімерів (нуклеїнових кислот чи білків). В основному для цього використовується запропонована Карлом Везе молекула 16S рРНК для прокаріотних (18S рРНК — для еукаріотних організмів). Ці молекули входять до складу рибосом, які у всіх організмів відповідають за самий важливий життєвий процес — синтез білка, тому є високо консервативними і можуть вважатися своєрідним біологічним "хронометром".
16S рибосомна РНК
33
Схема технології філогенії генів 16S рРНК
Методами секвенування та біоінформатичного аналізу (рис. 2.5.) визначають послідовності нуклеотидів у цих молекулах та шляхом порівняння їх методом кластерного аналізу з використанням відповідних комп’ютерних програм вираховують групи подібності (клади), що відображають їх родинні зв'язки та еволюційний розвиток. Схема технології, що лежить в основі філогенії генів рибосомної РНК включає: виділеня ДНК з клітин; копіювання генів, що кодують рРНК, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР); секвенування скопійованих генів; вирівнювання послідовностей та порівняльний аналіз послідовностей цього гена з інших організмів по кожній основі та побудова філогенетичного дерева.
34
На основі таких порівнянь було збудовано філогенетичне дерево, де всі представники живого світу розділені на три великі домени (надцарства): Bacteria, Archaea та Eukarya (рис. 2.3.). Домени Bacteria та Archaea містять лише прокаріотні організми, а домен Eukarya поєднує як одноклітинні, так і багатоклітинні (рослини, тварини) організми.
Традиційно члени доменів Bacteria і Archaea були згруповані разом як «прокаріоти», тому що вони мають просту внутрішню клітинну структуру без ядра. Проте найважливішим результатом трьохдоменного дерева життя є те, що ми тепер усвідомлюємо, що бактерії і археї - це різні філогенетичні групи. Археї не є специфічною, спеціалізованою групою бактерій, як вважалося раніше, а насправді є окремою групою, яка має більш тісні філогенетичні відносини до еукаріот, ніж до бактерій.
35
Ця концепція виявилася дуже важливою для формування нашого уявлення про еволюцію організмів. Порівняльний аналіз послідовностей рибосомних РНК також показав, що мітохондрії та хлоропласти мають прокаріотичне походження. Також виявлено все більше доказів широкого горизонтального перенесення генів між мікроорганізмами. Такі передачі відбуваються найчастіше між спорідненими організмами, але також можуть передаватися на більші генетичні відстані — навіть між доменами. Представники бактерій і архей містять деякі гени з дуже схожими послідовностями, члени Eukarya містять гени з обох інших доменів, а деякі члени домену Bacteria містять еукаріотичні гени.
Для ідентифікації конкретного мікроорганізму виділяють його чисту культуру та проводять аналіз нуклеотидної послідовності 16S рРНК. Усі нуклеотидні послідовності вивчених організмів дослідники вносять до всесвітнього комп'ютерного генбанку (GenBank), який використовується для ідентифікації знов виділеного мікроорганізму шляхом порівняння його послідовностей з послідовностями в генбанку.
36
Порівняння з уже відомими послідовностями дозволяє віднести ізольований мікроорганізм в одну із груп (кластерів) на філогенетичному дереві, враховуючи загальноприйняті рівні подібності послідовностей нуклеотидів: для виду > 97%, роду > 94%, родини > 92%, порядку > 90%, класу > 85%, філуму > 80%. Групи подібності, що формуються шляхом порівняння послідовностей називають «операційними таксономічними одиницями" (ОТО).
Для виявлення споріднених зв'язків у мікроорганізмів іноді використовують також деякі білкові молекули. Так, для дихаючих організмів застосовують визначення послідовності амінокислот у білка цитохрому с.
Для більш чіткої ідентифікації мікроорганізму на рівні виду та роду поряд з визначенням послідовностей нуклеотидів використовують ДНК-ДНК гібридизацію, морфо-культуральні та фізіолого-біохімічні ознаки. У деяких випадках для уточнення ідентифікації прокаріотичних мікроорганізмів використовують порівняння нуклеотидних послідовностей повного геному.
При ідентифікації бактерій і архей мікробіологи використовують Посібник Берджі з систематики бактерій (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology).
Різні способи побудови дендрограми: деревоподібний
38
Кільцева дендрограма
39
Філогенетичне дерево побудоване на порівнянні амінокислотних послідовностей в GroEL — білках родини молекулярних шаперонів
�
40
Сучасні проблеми таксономії та біологічної різноманітності морських мікроорганізмів.
Морський мікробіом.
Метагеноміка: вивчення біологічної різноманітності морських мікроорганізмів за аналізом послідовностей сумарної ДНК.
41
Map of OSD sites participants
42
Вивчення біологічної різноманітності морського прокаріотного мікробіому Чорного моря в Одеському регіоні методом метагеномного аналізу
за 16SрРНК
Кладограма, що демонструє співвідношення родів в воді�� ОСТРОВА ЗМІЇНИЙ
43
44
Бажаю успіхів!