Анализ модификаций гистонов на основании данных ChIP-Seq

1

План занятия

2

1. Гистоновые метки и ENCODE
2. Эксперимент ChIP-seq
3. Дизайн эксперимента
4. Биоинформатический анализ

Гистоновый год – названия меток

Что в химическом смысле означают метка H3K4me1, H3K36me, H3K36ac, H3K4me0?

​

Может ли на одной нуклеосоме находиться метки

H3K36me и H3K36ac

H3K36ac и H3K4me1

H3K4me1 и H3K4me3

H3K4me1 и H3K4ac

H3K4me1, H3K9ac, H3K14ac, H3K27me3, H3K36me3, H3K79me2, H4K12ac

?

Проект ENCODE – каталог всех функциональных элементов в геноме человека (энхансеры, промотеры и тп)

https://youtu.be/na4-OmbDNxw

Проект ENCODE – каталог всех функциональных элементов в геноме человека (энхансеры, промотеры и тп)

https://youtu.be/na4-OmbDNxw

Проект ENCODE – матрица со всеми экспериментами

https://www.encodeproject.org/matrix/?type=Experiment&status=released&perturbed=false

Проект ENCODE – данные ChIP-seq (клеточные линии)

Проект ENCODE – данные ChIP-seq (первичные клетки и органы)

Проект ENCODE – визуализация через UCSC геномный браузер

Проект ENCODE – визуализация через UCSC геномный браузер

ChIP-seq на транскрипционные факторы (Transcription Factors, TFs)

Chromatin

Immuno

Precipitation

ChIP-seq for TF

Nature Reviews Genetics 13, 840-852

Технология ChIP-Seq

13

http://ccg.vital-it.ch/chipseq/doc/chipseq_tutorial_intro.php

Library Preparation

Need sufficient amount of starting material because the ChIP will enrich for a small proportion

Ideally the starting material for one ChIP uses 10⁷ cells from culture

Crosslink proteins to DNA

https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)49515-8/pdf

Fragment

The DNA is sheared into small fragments - usually 200-500 bp in length

Check by running on a gel

Protein specific antibody

The sheared protein-bound DNA is immunoprecipitated using a specific antibody

Immunoprecipitate

The antibody binds primarily to the protein of interest but there may be cross reactivity with other proteins with similar epitopes

Reverse crosslink and purify DNA

Откуда антитела?

20

http://www.slideshare.net/nasagusto/monoclonal-antibodies-14851287

Давайте вернемся к шагам эксперимента и подумаем о потенциальных проблемах

Impact of sequencing depth

H3K4me3

Adapted from Jung et al (2014). NAR.

Impact of sequencing depth

H3K27me3

Adapted from Jung et al (2014). NAR.

Why are controls necessary?

• Signal depends on # active binding sites, the number of starting genomes, IP efficiency
• Open chromatin regions fragment more easily than closed regions
• Repetitive sequences might seem to be enriched
• Uneven distribution of sequence tags across the genome
• Hyper-ChIPable regions
• Allows us to compare with the same region in a matched control
• ENCODE also provides a “Black List”

17

ChIP-Seq Controls

18

Crosslink proteins to DNA

Shear DNA (sonication)

Reverse crosslink

Size selection and PCR

Immunoprecipitation

Non-specific antibody (IgG “mock IP”)

Specific antibody (ChIP enrichment)

+

No IP (Input DNA)

Biological samples/Library preparation

Сравнение сигнала и фона ("шума")

https://bioinformatics-core-shared-training.github.io/cruk-autumn-school-2017/ChIP/Materials/Lectures/Lecture5_Peak%20Calling_SS.pdf

Replicates and reproducibility

• Biological replicates are essential to understand variation and for differential binding analysis
• More replicates is often preferable to greater depth
• Better to sequence high- quality sample at lower depth than low-quality sample to higher depth

All binding

High confidence

2090

Sox2 Replicate 1

(4605)

Sox2 Replicate 2

(2382)

Bioinformatics analysis

Nature Protocols 7, 45–61 (2012)

Поиск пиков – peak calling

https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_peak_calling_macs.html

Программы поиска ChIP-seq пиков

https://bioinformatics-core-shared-training.github.io/cruk-autumn-school-2017/ChIP/Materials/Lectures/Lecture5_Peak%20Calling_SS.pdf

Peak callers

• Variability in number of peaks called
• Tend to agree on the strongest signals

WIlbanks & Facciotti (2010). PLoS ONE.

Проект ENCODE – визуализация через UCSC геномный браузер

Downstream analysis

• Detecting differential enrichment across samples
• Steinhauser et al, Brief Bioinform. (2016)

Figure 4. Proportion of true and false positives for each tool on the simulated FoxA1 data set (A, B) and H3K36me3 data (C, D)

Sharp ChIP-seq signal: FoxA1

Broad ChIP-seq signal: H3K36me3

​

Single replicate tools Multiple replicate tools

Decision tree indicating the proper choice of tool depending on the data set: shape of the signal (sharp peaks or broad enrichments), presence of replicates and presence of an external set of regions of interest [Steinhauser, et al, 2016].

Downstream analysis

• Annotation of peaks - distance from TSS
• ChIPseeker, Homer, ChiLin

Downstream analysis

• Annotation of peaks - genomic context
• ChIPseeker, Homer, ChiLin

Downstream analysis

• Functional enrichment analysis
• ChIPseeker, GREAT, Homer, ChiLin

Downstream analysis

• Motif discovery
• MEME suite, ChiLin, Homer

TF binding motif: PWM

If you need good motifs to compare...

http://hocomoco.autosome.ru/

De novo motif search

Nature Biotechnology 24, 959 - 961 (2006)

Software for de novo motif seach: MEME suite

ChIP-seq на гистоновые модификации

Белки, которые пишут и стирают гистоновый код

https://epifactors.autosome.ru/protein_complexes

В БД EpiFactors имеется информация про 69 белковых комплекса

(список не обновлялся несколько лет)

Где находятся инструкции о том где и что писать в эпигенетике?

Инструменты -- белковые комплексы, которые способны делать или убирать определенные эпигенетические модификации

Результат работы – наблюдаемые эпигенетические изменения/состояния в разных клетка организма

Инструкции? – кто указывает, что и где писать или стирать?

Длинные некодирующие РНК (lncRNA)

нкРНК MEG3 – образование триплексов

нкРНК CHASERR– ко-транскрипционное РНК-РНК вз-вия

В технологии CRISPR также используется нкРНК (gRNA)