Coloration de Gram
MAHMOUDI CHERIFA
Cette technique a été mise au point en 1884 par Hans Christian Gram, un bactériologiste danois.
La coloration de Gram reste une étape essentielle dans l’analyse médicale pour la détermination des pathogènes. ���
Elle permet de renseigner sur :
- Le type Gram + ou Gram -
- la forme des bactéries
- la taille
- le mode de regroupement
Structure de la paroi bactérienne
Les bactéries Gram-
Les bactéries Gram+
apparaissent en rose
apparaissent en violet
Préparation d’un frottis
Protocole
_ Nettoyer une lame avec l'alcool.
_ Déposer une goutte d'H20 sur la lame.
_ Toucher une colonie à l'aide d'un cure-dent stérile pour prélever des bactéries. Il n'est pas nécessaire de prendre beaucoup de bactéries.
_ Frotter la pointe dans la goutte d'eau.
_ Laisser sécher à l'air.
_ Passer la lame dans la petite flamme du bec Bunsen pour fixer l'échantillon à la chaleur.
Coloration
_ Traiter par la solution de violet de gentiane (cristal violet), par quelques gouttes
sur le frottis fixée, laisser agir 1 minute.
Le violet de gentiane colore le cytoplasme des bactéries.
_ Jeter l'excès de colorant dans un bécher, rincer très brièvement en faisant couler de H20 sur la lame.
_ Déposer quelques gouttes de lugol sur le frottis, laisser agir 1 minute.
Le Lugol est un mordant qui permet de fixer le violet dans les bactéries.
_ Jeter la solution de Lugol dans un bécher et rincer très brièvement en faisant couler de H20 sur la lame, pas directement sur le frottis.
_ Décoloration (5 à 10 secondes),la solution de décoloration contient un mélange d'alcool et d'acétone : (Gram+)conservent la couleur violet, (Gram-)décolorent rapidement.
_ Rincer très brièvement avec l’H2O.
��_ Contre-colorer en déposant la solution de safranine ou fuchsine pendant 1 minute. ��_ Rincer à l'H2O. ��_ Laisser sécher à l'air. ��_ Observer au microscope (grossissement 40x ou, avec une goutte d'huile à immersion, au grossissement 1000x). �
Technique de coloration de GRAM