​

​

• Sau khi cố định, xử lí mô, đúc khối, cắt mỏng. Mẫu mô không màu, khó nhận dạng cấu trúc nên phải tiến hành nhuộm.

PHƯƠNG PHÁP NHUỘM�HE

PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HE

• HE là phương pháp nhuộm chính trong xét nghiệm giải phẫu bệnh.

​

• Được sử dụng rộng rãi.

​

• Thích hợp với hầu hết các loại mô và cơ quan.

PHƯƠNG PHÁP NHUỘM

(Hematoxylin & Eosin)

Hematoxylin – nhuộm nhân

Eosin – nhuộm bào tương

HEMATOXYLIN

KIỂU NHUỘM HE

REGRESSIVE

• Nhuộm bằng Hematoxylin
• Mẫu mô nhuộm quá màu (overstained) với hematoxylin.
• Chất biệt hoá (Differentiator) được sử dụng để loại thuốc nhuộm thừa
• Quy trình nhuộm tiếp tục với chất nhuộm nền (Eosin)

Staining Systems

(Progressive v/s Regressive)

PR0GRESSIVE

• Nhuộm bằng Hematoxylin
• Mô được nhuộm bằng Hematoxyline ở một điểm.
• Không có chất loại màu Hematoxyline thừa.
• Quy trình tiếp tục nhuộm bằng chất nhuộm nền (Eosin).

Staining Systems

(Progressive v/s Regressive)

Regressive:

Stain Regress

(Harris hematoxylin)

​

Progressive:

Stain Rinse

(Mayer’s, Gill’s I & II)

Continue staining

Continue staining

Basic Chemistry

• Progressive staining:
• Cường độ màu được kiểm soát thông qua sự thay đổi thời gian nhuộm.
• Hematoxylin chỉ nhuộm một lần.

​

• Regressive staining:
• Mẫu mô nhuộm quá màu với Hematoxyline.
• Nền được loại bỏ bằng chất biệt hoá.

Differentiation

• Sử dụng dung dịch acid để loại màu thừa.
• Dung dịch Differentiation thường là acid mạnh. 70% alcohol with 0.5-1.0% HCl

Differentiation

• Dd Differentiation
• Tăng nồng độ (H⁺)
• Bẻ gãy liên kết
• The bond between Al⁺³ and the tissue
• The bond between Al⁺³ and the hematein
• Over differentiation will remove staining

from the nuclei and dull the crispness.

BLUING

• Chuyển màu nhân từ đỏ sang xanh/tím
• Bluing là chất kiềm khoảng pH từ 7.5-9.0 là tối ưu
• Nước máy
• Nước Scott’s tap
• Ammonia
• Lithium Carbonate
• Dung dịch đệm

​

• Bluing là tăng độ tương phản của phết nhuộm HE.
• Màu Hematoxylin đổi sang xanh/tím.

CHÚ Ý

• Nước máy- pH không ổn định
• Ammonia water- pH có thể quá cao. Cod thể trôi mẫu.
• Scott’s tap water or buffered có pH ổn định thích hợp với mẫu mô.

EOSIN

(Eosin)

• Eosin có màu orange/pink (cam/hồng).
• Eosin là thuốc nhuộm acid
• Nguồn điện tích âm
• Eosin gắn với nguồn proteins điện tích dương ở bào tương và mô liên kết

(pH effects)

• Eosin Y mang điện tích âm pH of 3.5 và cao hơn.
• Gắn với điện tích dương ở mô.
• Cường độ nhuộm phụ thuộc vào pH.
• Trên mức pH 5 thì cường độ nhuộm

giảm đáng kể.

Dưới mức pH 4 cũng không tối ưu.

Relationship of pH and charge

pH of dye solution

(+) charge on tissue

Low pH solutions increase the number of

charged groups within the tissue

Relationship of pH and charge

pH of dye solution (+) charge on tissue

High pH solution decreases the number of charged

groups within the tissue

The H and E Stain

(balance of coloration)