1 of 19

Antibakteriální peptidy a proteiny jako štít proti bakteriálním nemocem

Mgr. Jiří Danihlík, Ph.D.

Katedra biochemie PřF UP

Praha, 13. 5. 2023

2 of 19

Imunitní systém včel

3 of 19

Mateří kašička:

royalisin

jelleiny

Hemolymfa:

apidaecin

abaecin

defensin

hymenoptaecin

Hemocyty

Fenoloxidasová reakce a tvorba melaninu

Antimikrobiální peptidy

Humorální imunitní systém včel

Med:

royalisin

Jed:

melittin

apamin

Danihlík et al., 2016 J Apicult Res

4 of 19

DNA

RNA

Protein

Translace

Transkripce

DNA

Replikace

Inhibice syntézy buněčné stěny:

Změny cytoplazmatické membrány:

melitin

Aktivace autolýzy

Inhibice enzymové aktivity

apidaeciny, abaecin

Inhibice tvorby DNA, RNA, proteinů

jelleiny, defensiny

Vazba na DNA

5 of 19

Brutscher et al., 2015

Honey bee immune pathways — highlighting genes implicated in antiviral immune responses. The honey bee genome encodes major members of insect immune pathways including: RNAi (RNA interference); Jak/STAT (Janus kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription); Toll; NF-kB (Nuclear Factor kB); JNK (c-Jun N-terminal kinase); and MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases), as well as orthologs of genes involved in autophagy, eicosanoid biosynthesis, endocytosis, and melanization. Bold text indicates genes and proteins differentially expressed in virus-infected honey bees. Additional information including Apis mellifera (Am) gene accession numbers is provided in Tables 1 and S1. The first step in immune activation is host recognition of pathogen associated molecular patterns (PAMPs) including viral dsRNA, bacterial peptidoglycans, and fungal b-glucans. In general, the Toll pathway is involved in defense against Gram(+) bacteria and fungi and the Imd pathway is activated by Gram() bacteria, but specific host–pathogen interactions are unique. This is particularly true for host–virus interactions since data from fruit-flies, mosquitoes, and honey bees indicate differential activation of immune genes and pathways. The Jak/STAT pathway is activated via ligand binding to the Domeless receptor; while Drosophila melanogaster (Dm) express Domeless ligands (unpaired, upd, upd2, and upd3), a honey bee upd ortholog has not been identified. Following Domeless-ligand binding, Hopscotch Janus kinases are transphosphorylated, leading to phosphorylation and dimerization of STAT92E-like proteins. Activated STATs transcriptionally regulate antimicrobial effectors TEP7 (Thioester- containing protein 7), TEPA, TEPB, and the Jak/STAT inhibitor SOCS (Suppressor of Cytokine Signaling). The honey bee genome also encodes for D-PIAS (Protein Inhibitor of Activated STAT), another inhibitor of the Jak/STAT pathway. The RNAi-pathway is initiated by Dm Dicer-2 cleavage of viral dsRNA into 21–22 bp siRNAs; Am Dicer-like share 30% aa identity with Dm Dicer-2. The siRNAs are then loaded into AGO2 (Argonaute-2), the catalytic component of the RISC (RNA Induced Silencing Complex). A single strand of the siRNA is retained in the RISC and used to specifically target cognate viral genome sequences for cleavage. In addition, Dm Dicer-2 serves as a dsRNA sensor that mediates a signal transduction cascade resulting in increased expression of Dm Vago and suppression of viral replication. Am Dicer-like may serve as a dsRNA sensor, and honey bees have a vago ortholog (Table S1), but the mechanism(s) of honey bee non-specific dsRNA-mediated antiviral responses require additional characterization. The Toll pathway is activated by a family of pathogen recognition receptors (PRRs) (e.g., peptidoglycan receptor proteins and Gram() binding proteins) that bind fungal and bacterial PAMPs. The Toll pathway is activated in some insect host–virus combinations, although the activation mechanism is unknown. Following PAMP binding, a serine protease cascade results in cleavage of pro- Spaetzle into mature Spaetzle. The honey bee genome encodes two putative spaetzle orthologs, which bind the membrane-anchored Toll receptor. Toll dimerization results in the recruitment of dMyD88, Tube, and Pelle. Pelle is likely involved in degradation of NF-kB inhibitors (e.g., Cactus-1, Cactus-2, Cactus-3), resulting in the release of transcription factors Dorsal-1A and Dorsal-1B. Nuclear translocation of Dorsal results in increased expression of antimicrobial peptides (AMPs). The Imd pathway is activated by Peptidoglycan recognition protein LC (PGRP-LC) binding to diaminopimelic-containing peptidoglycan of Gram() bacteria, followed by activation of the adaptor protein Immune deficiency (IMD), Relish phosphorylation by the IKK complex (IkB kinase), and cleavage of Relish by the caspase Dredd (Death-related ced-3/Nedd2-like). Relish transcriptionally regulates expression of AMPs and other genes involved in antimicrobial defense. The JNK pathway is also activated by TAB (Transforming growth factor-activated kinase 1) and TAK1 (Transforming growth factor-activated kinase 1 binding protein), resulting in AMP

(Figure 1 legend continued) expression and/or apoptosis. In Drosophila, binding of vesicular stomatitis virus to the Toll-7 receptor promotes autophagy, likely by inhibiting the PI3/Akt/Tor (phosphatidylinositol 3-kinase/Protein kinase B/Target of rapamycin) pathway which suppresses autophagy. The honey bee genome encodes for one gene of the Toll-7/2 clade, 18-wheeler (am18w), which shares 49% aa identity with Dm Toll-7 and 45% aa identity with Dm Toll-2. The role of Am18w protein in antiviral defense and autophagy in honey bees is unknown. In insects, Eicosanoid biosynthesis begins with the induction of PLA2 (Phospholipase 2) from signal cascades downstream of viral, fungal, or bacterial PAMP recognition. Activated PLA2 hydrolyzes arachidonic acid (AA) from cellular phospholipids. Eicosonoid production likely occurs via oxidation of AA by an unidentified enzyme. Eicosanoids are critical for nodulation and aid in phagocytosis, micro-aggregation, adhesion, and release of prophenoloxidase (PPO) from hemocytes. Experimental evidence also suggests endocytosis, melanization, and MAPK pathways are involved in honey bee antiviral defense.

6 of 19

Pokud včelám chybí pyl, neprodukují antimikrobiální peptidy

Danihlík et al., Insects (2018)

7 of 19

Kvalitní výživa – jeden z pilířů imunity

Upraveno dle Dostálková et al., Veterinářství (2019)

8 of 19

Odlišuje se zimní a letní populace v imunitních reakcích?

9 of 19

Letní a zimní populace včel ve včelstvu

Letní generace

Krátkověké včely

(délka života 30-40 dní)

Dlouhověké včely

(délka života 80-130 dní)

Zimní generace

10 of 19

Experimentální design studie

Včely definovaného stáří (10 dní), vývoj za přirozených podmínek ve včelstvu

Imunitní stimul 🡪 injekce suspenze mrtvých bakterií

Po 24 hod stanovení parametrů imunitního systému

11 of 19

Zimní generace včel vykazuje výrazný nárůst gen. exprese po imunitním stimulu

Abaecin

Letní: nárůst 5x

Zimní: nárůst 10x

Letní: nárůst 4x

Zimní: nárůst 14x

Letní: nárůst 35x

Zimní: nárůst 27x

Defensin-2

Letní: nárůst 91x

Zimní: nárůst 400x

Defensin-1

Letní: nárůst 16x

Zimní: nárůst 34x

Apidaecin

Hymenoptaecin

12 of 19

U zimní generace včel dochází k mnohem intenzivnější aktivaci imunitního systému
Intenzivní aktivace imunity vede k poklesu hladiny a relativní gen. exprese proteinu vitellogeninu

13 of 19

Do včelařské praxe…

Varroóza 100× jinak

14 of 19

Kyselina šťavelová s glycerinem – nový způsob ošetřování včelstev?

15 of 19

Experiment s KŠ-G

aplikace

v den těsně před aplikací

Odběr 1

-1-3 dny: zničit/odebrat zavíčkovaný plod

1. den po aplikaci

2. den po aplikaci

3. den po aplikaci

7. den po aplikaci

Odběr 2

Odběr 3

Odběr 4

Odběr 5

Kontrola

KŠ-Pokap

KŠ-Glycerin

Gabon Flum

16 of 19

Aplikace OAG

Odběr a převoz včel do laboratoře

Zpracování včel v laboratoři

Cca 800 dělnic k odběru hemolymfy denně

17 of 19

Pinďáková et al., článek v přípravě

Aplikace KŠ-G zvyšuje aktivitu imunitního systému

18 of 19

Závěrem

Antimikrobiální peptidy – ochrana larev i dospělců
Zimní a letní generace – rozdílné nároky na imunitu
Další výzkum – imunitní priming, podpora tvorby AmP…

Vliv účinných látek léčiv na imunitní systém
Optimalizace technik zvládání chorob a jejich robustnost pro chovatele
Kvalitní výživa – očím skrytý vliv na dobré zdraví včelstev

19 of 19

Děkuji za pozornost!

NAZV QJ1610248 a NAZV QK1910286

Poděkování grantům, bez kterých by tyto výsledky nebyly…

Mgr. Jiří Danihlík, Ph.D.

Katedra biochemie PřF UP

e-mail: jiri.danihlik@upol.cz

www.coloss.cz

www.uhynyvcelstev.cz

Youtube kanál s přednáškami

Prezentace ke stažení + materiály