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�La expresión de PD-L1 inducida por IFN-γ en los melanocitos humanos está alterada en el vitíligo

De Flammineis D. R1

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Introducción

  • Vitiligo:
    • Trastorno pigmentario caracterizado por la aparición de manchas blancas en la piel debido a la pérdida de melanocitos funcionales.
    • La destrucción de los melanocitos se origina a partir de linfocitos T CD8+ autorreactivos específicas a los melanocitos.
    • Las linfocitos T de memoria contribuyen al desarrollo y persistencia del vitiligo.

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Introducción

  • Puntos de control inmunitarios:
    • Muerte celular programada 1 (PD – 1): modulan la respuesta inmune mediante la regulación de la tolerancia periférica, evitando respuestas inflamatorias no deseadas y autoinmunidad.
    • En la inmunoterapia de melanoma se demuestra que los anticuerpos anti – PD -1 pueden romper la tolerancia periférica y reactivar respuestas antitumorales.
    • 2 – 43% de los pacientes con melanoma tratados con inmunoterapia producen una despigmentación similar a la del vitiligo 🡪 indica presencia de reactividad inmunitaria, asociado a pronóstico favorable.

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Introducción

  • Ya que el vitiligo puede desarrollarse posterior al tratamiento con anticuerpos anti PD – 1, sugiere que este y su ligando (PD – L1) pueden encontrarse involucrados en la regulación de la tolerancia en los melanocitos.
  • El tratamiento con PD – 1 o PD – L1 parece ser una estrategia prometedora para el vitiligo.
  • Las alteraciones de esta ruta se encuentra implicada en numerosas enfermedades autoinmunes 🡪 justificando el potencial terapéutico de aumentar la señalización.

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Introducción

  • IFN-γ 🡪
    • crucial en la patogenia del vitiligo
    • induce la evasión inmunitaria mediante la expresión de PD – L1 en el melanoma.
  • Hasta que punto se produce un aumento de la expresión de PD – L1 y la consiguiente regulación inmunitaria en el vitiligo.

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Objetivos

    • Estudiar la expresión in situ de PD – 1 y PD – L1 en muestras de vitiligo humano.

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    • Investigar el papel de la señalización del punto de control de PD -1/ PD – L1 en la destrucción de los melanocitos en el vitiligo y como influyen en ello los interferones.

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Métodos

  1. Muestra de pacientes con vitiligo n = 22
    • Biopsias de pacientes con vitiligo no segmentario en saca bocados de 2 – 4 mm de piel de vitiligo no lesional y perilesional.
    • Edad: ≥18 años.
    • Puntuación de la actividad del vitiligo VIDA
      • Vitiligo activo: progresión en los 6 meses anteriores a la inclusión (+4 o +2).

Muestra de pacientes Sanos: n = 8

    • Biopsias de donantes sanos a través de tejido posterior a cirugía plástica de mama y abdomen

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Métodos

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Métodos

  1. Inmunohistoquímica:
    • La tinción con inmunohistoquimica se realizo en secciones de tejidos congelados.
    • Las secciones de 4μm se pre incubaron con anticuerpos:
      • Anti CD3 humano, Anti PD – 1 humano, Anti PD – L1 y Anti Melan – A humano.

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Métodos

  1. Cuantificación de los análisis de tinción de inmunohistoquimica de las secciones del tejido.
    • Se analizó a través de un microscopio de campo de alta potencia y el análisis de la muestra de realizó por secciones
  2. Preparación del tejido
    • Las biopsias se degradaron enzimática y mecánicamente, luego se recogieron las células filtrándolas, se incubaron y separaron la dermis de la epidermis.
  3. Cultivo celular: se cultivaron
    • Melanocitos y fibroblastos primarios, línea celular de queratinocitos humanos, suspensiones de células epidérmicas.

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Métodos

  1. Exposición a citoquinas
    • Las células se expusieron a citocinas durante 24 horas y luego a IFN-γ durante 48 horas. Luego se cosecharon para el análisis cuantitativo por PCR y citometria de flujo.
  2. Aislamiento de ARN, síntesis de ADN y PCR cuantitativa
    • ARN total se extrajo siguiendo los protocolos y se transcribió en ADN.
    • Los niveles de expresión génica de PD – L1 se midieron mediante PCR cuantitativa. Se utilizaron secuencias de nucleótidos especificas
    • Los niveles se calcularon y normalizaron con respecto a los genes de referencia.

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Métodos

  1. Citometría de flujo
    • Para detectar el efecto de la exposición a las citoquinas, las células se tiñeron para el análisis por citometría de flujo. Se utilizaron los anticuerpos Anti PD – L1, Anti – CD19 y Anti Melan – A.
  2. Ensayo de biopsia de piel
    • Se utilizaron criosecciones de biopsias de piel las cuales se cultivaron para promover el crecimiento de linfocitos T. Las biopsias de piel no lesionales se co cultivaron junto con linfocitos T. Posteriormente se realizo el análisis inmunohistoquímico en criosecciones.

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Métodos

  1. Análisis de expresión génica
    • La plataforma de análisis y visualización genómica R2 se utilizó para el análisis de expresión génica de las biopsias de la piel lesional y no lesional de pacientes con vitiligo no segmentario.
  2. Análisis estadístico
    • el análisis se realizo con el Software Graphpad Prism. Las comparaciones se analizaron con el análisis ANOVA. Las correlaciones se realizaron mediante el análisis de regresión linear.
    • Valores p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.  

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Resultados

  1. Evidencia de linfocitos T PD – 1+ en piel perilesional, pero pocas Células PD – L1+ en piel perilesional de vitiligo.

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    • Para explorar el papel de PD – 1 /PD – L1 en el vitiligo, se estudio la expresión in situ de PD – 1 y PD – L1 en la piel perilesional del vitiligo.

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Resultados

Se observaron las células CD3+ en todas las biopsias de piel de vitiligo perilesional.

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Resultados

Se observaron células PD – 1+ que estaban presentes en el 100% de biopsias de piel de vitiligo perilesional y la gran mayoría de las células PD – 1 + se co - localizaron con las células CD3+ 🡪 lo que indica la presencia de linfocitos T que expresaban PD – 1.

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Resultados

  • La expresión de PD – L1 estaba ausente en gran medida en la piel de vitiligo perilesional.
  • Las células epidérmicas no expresaban PD – L1 en las muestras de la piel de vitiligo, mientras se expresaban en las células dérmicas en el 46% de los pacientes.

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Resultados

  • El 78% de las células que expresaban PD – L1 estaban co – localizadas con infiltrados de linfocitos T.

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  • Ni los melanocitos ni otras células epidérmicas de los pacientes con vitiligo expresaban PD – L1, mientras que si habían linfocitos T que expresaban PD – 1.

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Resultados

  1. Los interferones tipo I y II inducen la expresión de PD – L1 en las células sanas del donante
    • Se investigó hasta que punto la expresión de PD – L1 en las células de la piel humana puede encontrarse influenciada por las citocinas presentes en el microambiente de la piel.
    • Se sabe que los linfocitos T CD8+ de la piel del vitiligo perilesional producen altas concentraciones de IFN-γ y que este puede inducir la expresión de PD – L1 en el melanoma.

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Resultados

  • Las células dendríticas plasmocitoides productoras de IFN-α se infiltran en la piel de vitiligo activa y aunque la expresión de PD-L1 es regulada principalmente por el IFN-γ en el melanoma, la estimulación con interferones de tipo I también condujo a un aumento de la expresión de PD-L1.
  • La exposición al IFN-γ, pero también a los interferones de tipo I, aumentó la expresión de PD-L1 en melanocitos humanos derivados de donantes sanos.
  • La expresión de PD-L1 se indujo significativamente tras la exposición a las citocinas.

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Resultados

  • Los queratinocitos y HaCat mostraron un aumento de la expresión de la proteína PD – L1 tras la estimulación con IFN-γ.
  • Esto demuestra que el IFN-γ y los interferones de tipo I pueden inducir el aumento de la expresión de PD – L 1 en las células sanas de los donantes.

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Resultados

  1. La exposición al IFN-γ no induce la expresión de PD-L1 en los melanocitos del vitíligo.

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    • Se demostró que la PD – L1 puede aumentar su expresión en varios tipos de células de la piel sana, incluidos los melanocitos tras la exposición al IFN-γ.

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Resultados

  • el IFN-γ se correlaciona positivamente con la expresión de PD – L1 en la piel del vitiligo lesional.
  • Los niveles de IFN-α no fueron significativamente diferentes entre la piel lesional y no lesional en este conjunto de datos.

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Resultados

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Resultados

  • La exposición de células cutáneas de donantes sanos al IFN-γ provoco un aumento de la expresión de PD – L1 tanto en melanocitos como en otras células cutáneas.
  • Los melanocitos del vitiligo no aumentan la expresión de PD – L1 tras la exposición al IFN-γ.

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Resultados

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Resultados

  • Debido a que los linfocitos T CD8+ productores de IFN-γ están presentes en grandes concentraciones en la piel afectada por el vitiligo, se analizo la expresión de PD – L1 inducida por citocinas.

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Resultados

  • El ataque de los linfocitos T a los melanocitos en la piel del vitiligo no lesional, no produce un aumento de la expresión de PD – L1 en los melanocitos.
  • Por lo que los melanocitos de los pacientes con vitiligo difieren de los donantes sanos en su susceptibilidad a la inmunidad de los linfocitos T reactivos a los melanocitos.

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Discusión

  • Este estudio revela importantes conocimientos sobre la señalización PD – 1/ PD – L1 en el vitiligo humano.
  • Demostraron que las células PD – 1+ estaban presentes en abundancia en la piel del vitiligo, pero que ni los melanocitos ni otras células epidérmicas de la piel expresaban su ligando PD – L1.
  • Los melanocitos del vitiligo no aumentan la expresión de PD – L1 tras la exposición de IFN-γ.
  • Los melanocitos del vitiligo parecen incapaces de inhibir el ataque de los linfocitos T autorreactivos a través de la via PD – 1/ PD – L1.

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Discusión

  • Tanto los linfocitos T reguladores CD4+ como CD8 + que expresan PD – 1 eran mas abundantes en los pacientes con vitiligo que en la de los donantes sanos.
  • El porcentaje de los linfocitos T reguladores disminuía significativamente en los pacientes con vitiligo.
  • Las células PD – 1+ en la piel del vitiligo son principalmente linfocitos T de memoria CD8 reactivos a los melanocitos.

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Discusión

  • Este estudio demuestra la ausencia de expresión de PD – L1 en la piel perilesional del vitiligo y la alteración de su expresión en pacientes con vitiligo.
  • No hay estudios que determinen si existe alteración genética en los pacientes con vitiligo que esté implicado en las vías de señalización del receptor de IFN-γ que regulan la expresión de PD – L1.
  • Esto sugiere un papel de PD – L1 en la falta de tolerancia periférica en el vitiligo proporcionando una justificación para actuar sobre este eje en el tratamiento del vitiligo.

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Conclusiones

  • Demuestra la ausencia de expresión de PD – L1 inducida por IFN-γ por parte de los melanocitos de pacientes con vitiligo y por lo tanto revela un posible defecto intrínseco de los melanocitos en el vitiligo.
  • También destaca la presencia de los linfocitos T que expresan PD-1 en la piel del vitiligo, lo que refuerza la idea de manipular la señalización de PD – 1/PD – L1 para inducir la tolerancia periférica a los melanocitos del vitiligo.

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Willemsen M, Krebbers G, Tjin E, et all. INF –y- induced PD – L1 expression on human melanocytes is impaired in vitiligo. Exp Dermatol. 2022;31: 556 – 566.