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Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale

FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI

CORSO DI LAUREA IN FISICA

Anno Accademico 2013/14

Relatore: Prof. Tullio Scopigno

Correlatore: Dott.ssa Abigail Nunn

Candidato: Saltarelli Francesco

Roma, 26 Settembre 2014

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Introduzione

Negli epatociti vi può essere un accumulo anomalo di lipidi sotto forma di goccioline:

dovuto a patologie (steatosi epatica, cancro)
indotto esternamente (acido oleico, entinostat)

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Healthy liver

Fatty liver

0.In questa dissertazione siamo partiti da immagini di epatociti ossia le cellule maggiormente presenti nel fegato e abbiamo studiato l’accumulo lipidico che in esse si forma. Tale accumulo puo’ essere dovuto a patalogie o, come nel nostro caso, stimolato da un trattamento con specifiche sostanze come l’acido oleoico, un acido grasso, o l’entinostat, un medicinale sperimentale anticancro. Nelle immagini vediamo il raffronto fra un fegato sano con un minimo accumulo lipidico ed uno malato di steatosi epatica dove sono presenti accumuli di lipidi

1.Quello che abbiamo fatto e’ stato sviluppare un metodo per studiare la disposizione di tali gocce attraverso il calcolo della funzione di distribuzione radiale con opportuni script in matlab

2.Inizieremo spiegando brevemente le tecniche con cui tali immagini sono state acquisite e termineremo mostrando i risultati ottenuti per una cellula

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0. Le immagini degli epatociti sono state acquisite con un microscopio CARS. Per capire, in breve, in cosa consiste consideriamo la DIFFUSIONE DI FOTONI da parte di una MOLECOLA. Se tali fotoni hanno ENERGIA insufficiente a causare transizioni elettroniche ma superiore a quella per portare il sistema al primo livello vibrazionale eccitato il sistema si portera’ in uno stato virtuale da cui ricadra’ con massima probabilita’ nello stato fondamentale e raramente nel primo stato vibrazionale eccitato emettendo dunque un fotone a frequenza piu’ bassa. Tale diffusione e’ note come Stokes Scattering. La differenza di frequenza fra fotone emesso e ricevuto ci indica il salto energetico del primo livello vibrazionale eccitato rispetto allo stato fondamentale e dunque CARATTERIZZA la MOLECOLA investita dal fascio. Analogamente e’ anche possibile che il sistema parta dallo stato vibrazionale eccitato, vada in uno stato virtuale e dunque ricada nello stato fondamentale, cio’ e’ noto come Anti-Stokes Scattering. La probabilita’ dello scattering di anti-stokes rispetto allo stokes dipende dalla popolazione termica iniziale dello stato fondamentale e del primo eccitato.

1.L’effetto Raman consente di individuare le molecole investite dal fascio ossia ha SELETTIVITA’ CHIMICA ma e’ molto debole; tuttavia inviando due fasci sulla molecola distanziati in frequenza di una quantita’ pari al salto en vibrazionale fra stato fondamentale e primo eccitato, grazie ad un fenomeno di OTTICA NON LINEARE che implica un’interazione a piu’ fotoni abbiamo che il segnale di ANTI-STOKES e’ emesso molto piu’ INTENSAMENTE consentendo dunque l’uso di tale tecnica per fini di microscopia.

2.Nel caso dei LIPIDI la distanza in frequenza fra fascio di pump e stokes deve essere di 2841 cm^-1 ossia il salto vibrazionale di stretching del legame CH presenti nel gruppo CH_2 dei lipidi

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Schema microscopio invertito CARS

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Stack di immagini associato ad una cellula

(trattamento: acido oleico + entinostat)

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Nella fase di processing otteniamo dallo stack di immagini acquisite al microscopio posizione e area di ogni goccia per ogni layer

Threshold: si fissano due soglie, i pixel con un'intensità al loro interno rappresentano il segnale, gli altri lo sfondo nero

Watershed: divide le gocce rimaste unite cercando il loro centro e dilatandolo finche’ incontra un’altra goccia o raggiunge il limite della goccia stessa a cui il centro appartiene

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Algoritmo interno Fiji: si fissa una soglia di threshold uguale per l’intero stack e poi si esegue il watershed

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3D Iterative Thresholding plugin: sceglie una soglia di threshold diversa per ogni goccia seguendola sull’intero stack di immagini e tiene quella che massimizza il volume

Il plugin esterno ha prestazioni migliori in termini di capacità di distinguere le gocce e stimarne le dimensioni

0.Eseguendo threshold e watershed con i tool integrati in Fiji siamo costretti a scegliere delle soglie GLOBALI per l’intero stack di immagini. Cio’ e’ piuttosto problematico infatti tali soglie vanno scelte cercando da un lato di identificare ogni goccia e dall’altro di dividere le gocce piu’ grandi e vicini, risultati che si ottengono con impostazioni opposte

1.Per superare tale problema possiamo sfruttare un plugin esterno che sceglie in automatico una soglia di threshold locale ottimale per ogni goccia. Cio’ e’ fatto analizzando l’intero stack di immagini e facendo in moto che ogni goccia risulti il piu’ grande possibile pur rimanendo distinguibile da quelle vicine

2.Dal confronto proposto si vede come il plugin esterno distingua piu’ chiaramente le gocce e dunque lo abbiamo preferito ai tool integrati in Fiji

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Mappa delle gocce di lipidi in una cellula

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Nel caso di volume finito possiamo:

tenere conto del volume effettivo in cui cerchiamo vicini per le particelle al bordo;
introdurre PBC (minimum image convention)

Ciò non è applicabile al caso delle cellule dove il bordo non è ben definito

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0.Lavorano in un volume finito o area come nel caso dell’immagine in alto vediamo che fissata una certa corona circolare in cui cerchiamo vicini, per le particelle centrali, come quella rossa, avremo che tale corona e’ tutta contenuta nell’immagine; differentemente, per quella blue, abbiamo che la parte viola di corona non e’ contenuta nell’immagine e dunque non va considerata nel denominatore per il calcolo della g(r)

1.Alternativamente potremmo definire PBC e immaginare di replicare l’area in cui abbiamo fatto evolvere le particelle in un reticolo, in tal modo, secondo la minimum image convention, ogni particella interagisce con l’immagine piu’ vicina delle altre particelle

2.Tutto cio’, che applicheremo al caso di una simulazione LJ per verificare gli script sviluppati, non e’ utilizzabile nel caso delle cellule dove il bordo non e’ neanche ben definito

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Nel caso delle cellule resta il problema di definire un’area effettiva, ossia una zona dove la distanza fra le gocce è paragonabile alle dimensioni stesse di queste ultime; lo facciamo dividendo l’immagine in rettangolini e stabilendo una densità di soglia

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Cellula trattata con acido oleico e entinostat

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Cellula trattata con acido oleico

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Prospettive future

La funzione di distribuzione radiale ha delle caratteristiche peculiari che rispecchiano aspetti osservabili qualitativamente nelle immagini come:

presenza di picchi → ordine nella disposizione delle gocce
posizione dei picchi → disposizione più o meno compatta delle gocce
larghezza dei picchi → diversità nelle dimensioni delle gocce

L’idea, a lungo termine, è quella di costruire una banca dati con tali informazioni e confrontare la risposta delle cellule a diversi trattamenti, al fine di avere più chiaro il loro effetto

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