Atelier Variant

niveau 2

Nadia BESSOLTANE - INRAe

Bastien JOB - Gustave Roussy

Wilfrid Richer - Institut Curie

École de bioinformatique niveau 2 AVIESAN-IFB-INSERM 2021

https://www.genome.gov/Health/Genomics-and-Medicine/Polygenic-risk-scores#one

Définition

Il existe différents types de variations :

• SNV : Single Nucleotide Variant
• INDEL : INsertion ou DELetion
• SV (Structural Variant)
• CNV (Copy Number Variation)

Niveau 1...

3

Fastq Quality Control

-- FastQC --

Mapping

-- Bowtie2/Bwa --

Reads (Fastq)

Reference genome (Fasta)

Processing Post Alignement

Variant Calling

SNV & InDels

Filtrage & Annotation

Variants Structuraux

UNIX

Niveau 2 ...

4

Fastq Quality Control

-- FastQC --

Mapping

-- Bowtie2/Bwa --

Reads (Fastq)

Reference genome (Fasta)

Processing Post Alignement

Variant Calling

& Annotation

QC & Filtres

Recherche de marqueurs

Copy Number

​

• Analyse des variants post-VCF (SNV & InDel) : contrôle qualité, filtres, recherche de marqueurs (Nadia B.)
• Variations du Nombre de Copies (CNVs) (Bastien J.)

5

Objectifs�

Analyse de variants

post-VCF

Nadia BESSOLTANE - INRAE

École de bioinformatique niveau 2 AVIESAN-IFB-INSERM 2021

7

Rappel : du fastq au VCF�

Rappel : du fastq au VCF�

VCF (variant call format)

vcfR package

Manipulate and Visualize VCF Data

• CRAN : https://cran.r-project.org/web/packages/vcfR
• Reference manual : https://cran.r-project.org/web/packages/vcfR/vcfR.pdf
• Vignettes :
• https://cran.r-project.org/web/packages/vcfR/vignettes/intro_to_vcfR.html
• https://cran.r-project.org/web/packages/vcfR/vignettes/vcf_data.html
• vcfR documentation :
• https://knausb.github.io/vcfR_documentation/index.html

​

CRAN : The Comprehensive R Archive Network

> ## installer le package

> #install.packages(“vcfR”)

> ## charger le package

> library(vcfR)

> ## afficher la description du package

> browseVignettes('vcfR')

> my.vcf <- read.vcfR(file=”pool.vcf.gz”)

objet de la classe vcfR

> # l’objet vcf appartient à quelle class

> is(my.vcf)

[1] "vcfR"

> # la liste des slots (sections)

> slotNames(my.vcf) #

[1] "meta" "fix" "gt"

> # vcf header

> my.vcf@meta

> # information about variants

> my.vcf@fix

> # genotype of each sample

> my.vcf@gt

Trois sections :

• meta-information == entête du vcf
• Fixed information == information par variant mais commune à tous les échantillons (position, allèles, qualité…)
• Genotype information == information de génotypage par échantillon

12

##fileformat=VCFv4.2

##FILTER=<ID=LowQual,Description="Low quality">

##FORMAT=<ID=AD,Number=R,Type=Integer,Description="Allelic depths for the ref and alt alleles in the order listed">

##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Approximate read depth (reads with MQ=255 or with bad mates are filtere

##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality">

##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype">

##FORMAT=<ID=PL,Number=G,Type=Integer,Description="Normalized, Phred-scaled likelihoods for genotypes as defined in the VC

##GATKCommandLine=<ID=HaplotypeCaller,CommandLine="HaplotypeCaller --min-base-quality-score 18 --emit-ref-confidence NONE

##INFO=<ID=AF,Number=A,Type=Float,Description="Allele Frequency, for each ALT allele, in the same order as listed">

##INFO=<ID=AN,Number=1,Type=Integer,Description="Total number of alleles in called genotypes">

##INFO=<ID=BaseQRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score from Wilcoxon rank sum test of Alt Vs. Ref base qualities

...

##INFO=<ID=ReadPosRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score from Wilcoxon rank sum test of Alt vs. Ref read positio

##INFO=<ID=SOR,Number=1,Type=Float,Description="Symmetric Odds Ratio of 2x2 contingency table to detect strand bias">

##contig=<ID=6,length=119458736>

##source=HaplotypeCaller

#CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT SRR1262731 SRR1262732

6 2 . T A 67.64 . AC=1;AF=0.500;... GT:AD:DP:GQ:PL 0/1:3,2:5:75:75,0,105 0/1:3,2:5:75:75,

6 4 . GT G 58.60 . AC=1;AF=0.500;... GT:AD:DP:GQ:PL 0/1:1,2:3:28:66,0,28 0/1:1,2:3:28:66,

6 9 . C CA 55.60 . AC=1;AF=0.500;... GT:AD:DP:GQ:PL 0/1:7,2:9:63:63,0,279 0/1:7,2:9:63:63,

​

​

VCF header

Body

objet de la classe vcfR

​

meta(DATA)

fix (data)

gt (génotype)

Jeux de données #1:

Chez le bovin, il existe un locus de caractères quantitatifs (QTL) lié à la production de lait, situé sur le chromosome 6, et plus exactement sur une région de 700 kb, composée de 7 gènes.

Les échantillons QTL+ sont caractérisés par une diminution de la production en lait et une augmentation des concentrations en protéine et lipide.

Quelle mutation est responsable de ce QTL ?

Pour le TP nous disposons des résultats du variant calling de 3 échantillons (en Multi-VCF annoté).

TP 1 : recherche de mutation dans un QTL

Miri Cohen-Zinder et al, Genome Research 2005, DOI:10.1101/gr.3806705

RMD

1- Se connecter sur Rstudio via JupyterLab

2- Aller dans l’espace projet

> setwd(“/shared/projects/my_project”)

​

3- Créer un répertoir TP

> dir.create(“TP_variants”)

​

​

4- Copier le matériel de TP dans le dir TP_variants

> file.copy(from = “/shared/projects/ebai2021_n2/DNAseq/variants/”,

to = “TP_variants”)

> setwd(“TP_variants”)

​

5- Changer le workspace.

Support de TP

Rappel : Filtre des variants

• De nombreux filtres peuvent être appliqués sur le VCF

→ type de variants à garder (SNVs seulement, Indels...)

→ région d’intérêt

→ filtres sur la qualité (seuils arbitraires : profondeur, génotype (0/1, 1/1), ratio allélique…)

→ GATK Bests Practices : recommendations selon des métriques spécifiques à GATK, différentes pour les SNVs des Indels

​

• Filtres difficilement transposables entre analyse :

→ dépendent de la question biologique

→ dépendent des outils utilisés

​

15

RMD

→ d’où l'intérêt de faire ses propres scripts

Rappel : Faux positif

• De nombreux variants Faux Positifs peuvent survenir des étapes précédentes :
• Artéfacts issus des cycle PCR pendant la préparation des échantillons
• Artéfacts liés à la technologie de séquençage (PacBio, HiSeq, NextSeq, … )
• Difficultées d’alignement (régions d’ADN répétées)
• Erreurs de lecture lors du “BaseCalling”

​

​

Rappel :

Faux positifs vs Filtres qualité

True Positive (polymorphisms,mutations)

False

Positive

Faux Négatif

True Négatif

Filtres/seuils

résultat final

Variant calling results

Plus on est stringent plus on va éliminer les faux positifs mais avec le risque de perdre de vrais variants

​

max de vrais variants

min de faux positifs

RMD

Rappel :

Faux positif vs Filtres qualité

True Positive (polymorphisms,mutations)

False

Positive

Filtres/seuils

résultat final

Variant calling results

Plus on est stringent plus on va éliminer de faux positifs mais avec le risque de perdre de vrais variants

​

max de vrais variants

min de faux positifs

RMD

TP 2 : Mapping-by-sequencing

Jeux de données #2: Projet SOJ « Suppressor Of jmj14 » N. Butel et I. Le Masson (IJPB - INRAe)

• Des publications récentes suggèrent que la marque H3K4me3 protège les gènes contre le mécanisme de silencing PTGS( post-transcriptional gene silencing) qui est un mécanisme de défense contre les acides nucléiques invasifs.
• Chez Arabidopsis thaliana, Le gène JMJ14 code pour une Histone H3K4me2/3 démethylase. Les plantes mutées pour ce gène (mutants jmj14) montrent une accumulation globale d’histones H3K4 di- et tri-methylées.

​

→ Afin de comprendre le rôle de JMJ14 dans la systémie de la PTGS et d’identifier ses partenaires, des cribles génétiques ont été réalisés visant à isoler des suppresseurs de la mutation jmj14.

RMD

TP 2 : Mapping-by-sequencing

Gène JMJ14 WT WT muté

Transgène JAP3 - + +

Phénotype :

couleur des nervures

Arabidopsis thaliana

Mutagénèse EMS

autofécondation

Grains

JAP3-jmj14/SOJ

X

JAP3-jmj14

JAP3-jmj14

F1

autofécondation

¼ F2 🡪

JAP3-jmj14/SOJ

Séquençage HiSeq3000

paired-end 150 pb

couverture 20X

pool de ~30 plantes

Jeux de données #2: Projet SOJ « Suppressor Of jmj14 » N. Butel et I. Le Masson (IJPB - INRAe)

Plan expérimental :

Données :

• 14 échantillons SOJ
• 1 échantillon JAP3-jmj14 🡪 contrôle

→ Pour le TP nous disposons des résultats du variant calling des 15 échantillons (en Multi-VCF annoté).

TP 2 : Mapping-by-sequencing

* Recherche des pics

Principe :

RMD