Лекція 4�Селекція промислових штамів мікроорганізмів.

��Цілі, які необхідно досягати біотехнологу при вдосконаленні продуцента�

1. Збільшення продуктивності у досягненні великого виходу метаболітів на одиницю біомаси.

2. Надати продуценту здатність використовувати менш дефіцитні та дешевші середовища.

3. Продуцент не повинен ретроінгібувати біосинтез кінцевого продукту.

4. Стійкість продуцента до бактеріофагів.

5. Невимогливість до обладнання

Головний тезіс біотехнолога

збільшення виходу цільового продукту

на одиницю біомаси продуцента.

Для скерування метаболізму

мікроорганізмів у потрібне русло

використовують два підходи:

генетичний, який базується на використанні мутагенезу і

фізіологічний (створення оптимальних для росту умов культивування).

Використання фізіологічного підходу

можливе лише за умови точних

відомостей про фізіологічну роль

відповідного процесу для продуцента,

шлях синтезу метаболіту й оптимальні

умови його синтезу.

Усі мікробіологічні процеси за характером

росту продуцентів поділяють на дві групи.

1)Продуценти, синтез цінного метаболіту яких пов'язаний з ростом продуцента. Для мікроорганізмів першої групи підбирають умови, оптимальні для росту культури

2) Продуценти, синтез цінного метаболіту яких не пов'язаний із процесами росту культури. Визначення оптимальних умов їх залежить від фази росту мікробів, у якій відбувається максимальне накопичення певного продукту.

У мікробіологічних виробництвах застосовують:

- природні штами мікроорганізмів (здебільшого для виробництва біомаси, бактерійних добрив і біоінсектицидів) ;

- штами, змінені в результаті мутагенезу;

- штами, одержані методами генної та клітинної інженерії.

​

​

​

ПІДБІР ВИХІДНОГО

МІКРООРГАНІЗМУ ДЛЯ СЕЛЕКЦІЇ

1. Для того щоб здійснювати промисловий синтез біологічно активних речовин та мати рентабельне виробництво штами, продуценти

повинні продукувати у середовище достатню кількість метаболіту.

2. Природні штами мікроорганізмів,

як правило, нездатні виділяти та накопичувати в живильному середовищі таку кількість продукту, яка могла б забезпечити низьку собівартість виробництва

3. Перед селекціонерами стоїть завдання правильно підібрати вихідний мікроорганізм для селекції.

​

Вибір вихідного штаму залежить:

1) від природних властивостей штаму;

2) обмежень, пов'язаних із складнощами систем регуляції синтезу як на генетичному, так і на алостеричному рівнях.

Штам мікроорганізму, здатний продукувати навіть невелику кількість того чи іншого метаболіту та відібраний для селекції, залучається до подальшої роботи з вивчення його природної мінливості за морфологічними та кількісними ознаками.

1. Вихідний штам розсіюють на чашки Петрі і відбирають кілька сотень клонів, що мають типову для цієї культури морфологію та

варіанти з деякими морфологічними відхиленнями.

​

2. Виробляють кілька пасажів для підтвердження того, що ці варіанти зберігають свої морфологічні особливості

​

3. Оцінюють рівень продукції цікавого метаболіту у варіантів з типовою для даної культури морфологією та з морфологічними відхиленнями

4. Декілька клонів з найвищим рівнем продукції по відношенню до рівня вихідної культури відбирають і перевіряють на продукцію в декількох повторах, а потім відбирають один клон, що має стійко високий рівень продукції. Така тривала процедура називається «чисткою вихідної культури»

Методи селекції промислових штамів мікроорганізмів

Селекція (з лат. selectio) означає

добір. Для спрямованої селекції

високопродуктивних штамів, які

використовуються у промисловості,

важливе значення має дослідження

генома мікроорганізмів, принципів

його організації та функціонування.

Головним завданням селекційної роботи є

реорганізація генома мікробної клітини з

переорієнтацією шляхів біосинтезу в

потрібному напрямі.

За зміною структури ДНК

• мутації поділяють на вставки, делеції, транзиції та трансверсії. Транзиції та трансверсії часто призводять до місенс-мутацій (мутацій зі зміною змісту), оскільки викликають заміну в білку однієї амінокислоти на іншу. Частина мутацій із заміною основи є нонсенс-мутаціями (беззмістовні мутації), які обумовлені появою кодонів, не кодуючих жодної амінокислоти. У цьому випадку синтез білка на зміненому кодоні переривається, а утворені незакінчені фрагменти білкової молекули, як правило, функціонально неактивні та піддаються швидкому протеолізу.

​

• За зміною ознак розрізняють морфологічні, фізіологічні та біохімічні мутації.
• За напрямом зміни ознак мутації бувають прямі та зворотні. Мутанти зі зворотними мутаціями до вихідного фенотипу називають ревертантами. При істинних зворотних мутаціях у ДНК відновлюється вихідна послідовність нуклеотидів і, відповідно, генотип.

​

За локалізацією розрізняють мутації цитоплазматичні та ядерні, чи хромосомні.

Хромосомні мутації можна розділити на 3 основні типи:

1 - зміни числа хромосом;

2 - зміни числа і порядку розміщення генів (перебудови хромосом або структурні зміни);

3 - зміни індивідуальних генів (внутрішньогенні зміни).

У селекції мікроорганізмів основне значення мають останні два типи мутацій.

Мутагенез

Существует еще один тип наследственной изменчивости - изменения, возниющие у прокариот в результате РЕКОМБИНАЦИИ генетического материала, при которой происходит частичное объединение геномов двух клеток. РЕКОМБИНАЦИЯ бактерий (ре- + лат. combino связывать, сочетать) - обмен участками бактериальных хромосом в результате конъюгации, трансформации или трансдукции, приводящий к появлению бактериальных клеток с новым сочетанием генов.

Конъюгация - направленный перенос генетического материала от клетки-донора в клетку-реципиент; необходим непосредственный контакт между клетками. Как правило, в клетку-реципиент переносится только часть генетического материала клетки-донора → образуется неполная зигота, или мерозигота (содержит часть генома донора и полный геном клетки-реципиента). Участки перенесенной от донора ДНК находят гомологичные участки в молекуле ДНК реципиента, между которыми происходит генетический обмен.

Рекомбинация между гомологичными (А) и негомологичными (Б) фрагментами ДНК

Спонтанні та індуковані мутації

• Спонтанні мутації виникають із частотою 10^-4 -10^-10 на одну генерацію. У мікроорганізмів виявлені гени-мутатори, що спричиняють підвищення рівня похибок у процесі реплікації ДНК і тим самим зумовлюють появу спонтанних мутацій.
• Мутації, що виникають під дією певного мутагенного фактора називають індукованими.

​

​

Трансформация бактерий - перенос ДНК, выделенной из одних клеток, в другие; не требуется непосредственного контакта между двумя клетками. Способность ДНК проникать в клетку-реципиент зависит как от природы самой ДНК, так и от физиологического состояния клетки-реципиента. Трансформирующей ДНК могут быть только высокомолекулярные двухцепочечные фрагменты, при этом проникать в бактериальную клетку может ДНК, выделенная из разных биологических источников, но включаться в геном - только ДНК с определенной степенью гомологичности.

​

Трансдукция - перенос генов из одной бактериальной клетки в другую с помощью умеренных фагов; возможна, если в процессе размножения фага одна из частиц случайно захватит фрагмент бактериальной хромосомы, как правило, содержащий очень небольшое число генов. Когда фаговая частица заражает бактерию-реципиент, бактериальная ДНК проникает в клетку таким же путем, как и фаговая. Между трансдуцированной бактериальной ДНК и гомологичным участком бактериальной хромосомы может произойти обмен → возникновение рекомбинанты, несущей небольшую часть генетического материала клетки-донора.

Еще один путь переноса генетического материала у прокариот осуществляется с помощью ПЛАЗМИД определенного типа, обладающих генами, обеспечивающими эту возможность:

• перенос собственного генетического материала;
• перенос хромосомных генов, плазмид, не обладающих способностью к самостоятельному переносу;
• передачу транспозонов из плазмиды в хромосому или другую плазмиду.

Плазмидам и другим нехромосомным генетическим элементам принадлежит основная роль в передаче генетической информации "по горизонтали".

Т.к. ДНК плазмиды и бактериальной клетки не имеют одинаковых нуклеотидных последовательностей, т. е. не являются гомологичными, рекомбинация между ними происходит не по механизму обмена, а по механизму встраивания.

Рекомбинации такого типа происходят также с участием транспозонов и IS-элементов при их перемещении (транспозиции) в пределах хромосомы. Встраивание плазмид и мигрирующих элементов помимо того, что приводит к введению в хромосому дополнительного генетического материала, может вызывать перестройку бактериального генома.

Фізичні мутагени: �

а) УФ-опромінення, при цьому утворюються димери піридинових основ, йдуть мутації на кшталт транзиції та трансверсії. Змінюється порядок зчитування генів лише на рівні трансляції.

б) рентгенівське опромінення

в) швидкі нейтрони

г) g-промені

д) ультразвук.

Хімічні мутагени: �

а) нітрозогуанідин - алкілує основи в реплікативної вилці, викликає мутації на кшталт трансверсії, транзиції та делеції,

б) нітрозометилсечовина – викликає трансверсію

в) акридинові барвники (акридиновий помаранчевий) - вставка іншого гена між основами

г) деякі протипухлинні антибіотики, які є ДНКтропними агентами.

• Біологічними мутагенами є фаг λ, інсерційні елементи (IS-елементи), транспозони (Тп). Вони інтегруються в хромосому і спричиняють мутації типу інсерцій. їхня інтеграція в реплікони здійснюється незалежно від системи загальної (гомологічної) рекомбінації клітин, що вимагає гомології у рекомбінуючих структур.

Доза мутагену

• Доза дії фізичного мутагену вимірюється в одиницях випромінювання, відповідно до типу радіації.
• Для хімічних мутагенів доза визначається концентрацією мутагену в суспензії, що обробляється, і витримуванням при певній температурі.
• При виборі дози мутагену орієнтуються на відсоток виживання оброблених мікроорганізмів. У селекційній роботі, як правило, використовують дози, що забезпечують виживання клітин у діапазоні від 0,1 до 50-80%.

​

Результати мутацій можуть проявлятися в різних змінах метаболізму клітини:

1. підвищення рівня синтезу біосинтетичних ферментів чи їх активності (наприклад, мутанти з порушеною структурою білка-репресора чи алостеричною нечутливістю);

2. блокування подальшого внутрішньоклітинного перетворення метаболіту;

3. блокування деградації продукту;

4. забезпечення ефективної екстракції продукту з клітини;

5. посилення позитивної регуляції синтезу продукту тощо.

Ступінчастий добір включає етапи мутагенезу,

а також виділення спонтанних мутантів.

Основними етапами селекції промислових штамів

мікроорганізмів при використанні індукованого

мутагенезу та ступінчастого добору є:

• вибір об'єкта;
• підготовка об'єкта до селекції;
• вибір мутагену і проведення мутагенезу;
• вибір методу селекції мутантів;
• перевірка властивостей відібраного штаму

Цю послідовність етапів можна повторювати аж до отримання шуканого результату.

Вибір об'єкта.

• Для продуцентів вторинних метаболітів, ферментів або полісахаридів вибір вихідного штаму визначається здатністю природного виду мікроорганізмів продукувати певну кількість необхідної речовини. У випадку, коли необхідну сполуку синтезують різні види мікроорганізмів, вибирають більш „технологічний" або вивчений штам.

​

Підготовка об'єкта до селекції

• Після вибору об'єкта вивчають його природну мінливість за морфологічними ознаками (типову форму колоній при рості на твердому субстраті) та визначають кількість продукту, що утворюється. Кількість продукту вимірюють в одиницях маси на об'єм культуральної рідини після певного часу культивування: мкг/л, г/л, тощо.

​

Вибір мутагену і проведення мутагенезу

• Готовий об'єкт піддають дії одного з мутагенів і відселекціоновують отримані мутанти.

Вибір методу селекції мутантів

1.Метод відбитків (реплік) для виділення ауксотрофних мутантів на мінімальному середовищі

2. Виділення стійких мутантів до лікувальних препаратів або до дії бактеріофагів (висіванні чутливих клітин на середовище, яке містить антибактерійний агент).

3. Пеніциліновий метод виділення мутантів

​

​

Основний недолік ступінчастого добору

• Це - значна трудомісткість. Робота зі створення активного штаму цим методом іноді займає багато років. Крім того, у процесі багаторазового мутагенезу крім мутацій, що підвищують продуктивність, у геномі продуцента накопичуються шкідливі мутації. Для елімінації таких мутацій необхідно одержувати ревертанти до дикого типу

Репарація

У багатьох мікроорганізмів існує система репарації -це зворотна мутація чи повернення до вихідного дикого штаму. Якщо ця система є у м/о, то для подолання цього явища необхідно

1. відбирати за потрібною біотехнологічною ознакою

2. відбирати по дефекту репарування.

Висновок

• вдосконалення біооб'єкта - це отримання біооб'єктів-продуцентів з мутаціями в геномі, які відрізняються від вихідного біооб'єкта у бік поліпшення біотехнологічних властивостей, зокрема у бік збільшення отримання цільового продукту.