1 of 44

​

Одноклеточное секвенирование�(single cell RNA-seq, scRNA-seq)

​

Благодарности за слайды:

Антонов Иван Валентинович

Зубрицкий Анатолий

Simon Andrews (simon.andrews@babraham.ac.uk)

Åsa Björklund (asa.bjorklund@scilifelab.se)

​

​

1

2 of 44

Классический RNA-seq�(bulk RNA-seq)

3 of 44

Зачем нужны адаптеры при секвенировании?

4 of 44

Баркод образца (Sample barcode)

А что если каждый образец содержит только одну клетку?

Тогда можно сказать, что мы используем клеточные баркоды (cellular barcodes)

5 of 44

Bulk vs. Single Cell RNA-Seq

6 of 44

Ткани - гетерогенны!

Несмотря на то, что клетки морфологически идентичны, они могут иметь отличающиеся уровни экспрессии некоторых генов.

Это делает ткани и популяции клеток гетерогенными на уровне транскриптома и, иногда, генома (иммунные).

7 of 44

Экспрессия РНК в ткани = “средняя температура по больнице”

Уровень РНК из фрагмента кишечника - это уровень РНК из какого источника?

  • Стволовые клетки.
  • Эпителий
  • Бокаловидные клетки
  • Кровеносные сосуды
  • Лимфатические
  • Соединительная ткань
  • Мускулатура
  • Нейроны
  • Симбиотические бактерии

https://medicine.nus.edu.sg/pathweb/normal-histology/colon/

8 of 44

9 of 44

9

Почему single cell?

Jovic D. et al. Single‐cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview //Clinical and translational medicine. – 2022.

10 of 44

10

11 of 44

12 of 44

Platforms

Isolation

strategies

Tissue

Cell numbers

Targets

UMI

Amplification

methods

Region

Published year

Smart-seq

FACS

Dissociated cell

Hundreds

/

×

PCR

Full-length

2012

Smart-seq2

FACS

Dissociated cell

Hundreds

/

×

PCR

Full-length

2013

Fluidigm C1

Micro-fluidic

Dissociated cell

Hundreds

No poly(A) -

×

PCR

Full-length

2013

Drop-seq

Microdroplets

Dissociated cell

Large number

No poly(A) -

√

PCR

3′ end

2015

10x Genomics

Microdroplets

Dissociated cell

Large number

No poly(A) -

√

PCR

3′ end

2016

MATQ-seq

FACS

Dissociated cell

Hundreds

No poly(A) -

√

PCR

Full-length

2017

Seq-Well

Micro-fluidic

Dissociated cell

Large number

No poly(A) -

√

PCR

3′ end

2017

CEL-seq

FACS

Dissociated cell

Hundreds

No poly(A) -

√

IVT

3′ end

2012

MARS-seq

FACS

Dissociated cell

Hundreds

No poly(A) -

√

IVT

3′ end

2014

inDrop-seq

Microdroplets

Dissociated cell

Large number

No poly(A) -

√

IVT

3′ end

2015

DNBelab C4

Microdroplets

Dissociated cell

Large number

No poly(A) -

√

PCR

3′ end

2019

Сравнение методов

13 of 44

FACS

14 of 44

10x Genomics

15 of 44

Технологии, которые лежат в основе прибора 10X�(гелевые шарики в эмульсии, Gel Bead-in-Emulsion - GEMs)?�

​

  • Гелевые шарики (gel beads):
    • Уникальные молекулярные индексы (Unique molecular identifiers, UMIs)
    • Клеточные баркоды (cellular barcodes)

​

​

​

  • Микрогидродинамика или Микрофлюидика (Microfluidics):
    • Разделение клеток по отдельным каплям жидкости

​

​

​

16 of 44

How 10X RNA-Seq Works

Cells

Barcoded Beads

Oil

RT Reagents

Gel Beads in Emulsion (GEMs)

17 of 44

Гелевые шарики в эмульсии�(Gel Bead-in-Emulsion, GEMs)

https://theseuslab.by/p100390910-stantsiya-dlya-raboty.html

18 of 44

How 10X RNA-Seq Works

Oligo dT

Cell barcode (same within GEM)

UMI (all different)

Priming site

19 of 44

How 10X RNA-Seq Works

Oligo dT

Cell barcode (same within GEM)

UMI (all different)

Priming site

AAAAAGATTCGTAGTGCTGATGCT...

Reverse Transcription

Mix RNAs

and Cells

Illumina Library Prep

20 of 44

How 10X RNA-Seq Works

Illumina

Adapter

Illumina

Adapter

UMI

Cell Barcode

3’ RNA Insert

Sample Barcode

Read 1

Read 2

Read 3

Sample level barcode – same for all cells and RNAs in a library

Cell level barcode (16bp) – same for all RNAs in a cell

UMI (10bp) – unique for one RNA in one cell

21 of 44

https://youtu.be/9YXRoaQyixQ

22 of 44

23 of 44

3’-end Sequencing w/ UMIs* (10X Genomics)

l

*unique molecular identifiers

24 of 44

25 of 44

26 of 44

27 of 44

https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0304416510001169-gr4_lrg.jpg

28 of 44

https://www.nature.com/articles/srep33883/figures/2

29 of 44

30 of 44

https://www.science.org/doi/10.1126/science.aar3131

31 of 44

​

Одноклеточное секвенирование – эпигенетика

31

32 of 44

Баркод молекулы (unique molecular indexes, UMI)

https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.1118018109

33 of 44

Bulk vs. Single Cell RNA-Seq

34 of 44

Визуализация scRNA-seq -- PCA, t-SNE …

35 of 44

Визуализация scRNA-seq -- PCA, t-SNE …

36 of 44

Проекты по секвенированию всех типов клеток scRNA-seq

GTex

Human Cell Atlas

37 of 44

Перепрограммирование клеток – нам нужны модели

38 of 44

Для чего нужно одноклеточное секвенирование в RNA-seq

39 of 44

Для чего нужно одноклеточное секвенирование в эпигенетике

40 of 44

Одноклеточные методы секвенирования по эпигенетике

41 of 44

Одноклеточные методы секвенирования по эпигенетике

42 of 44

Одноклеточные методы секвенирования по эпигенетике

43 of 44

Одноклеточные методы секвенирования по эпигенетике

44 of 44

Одноклеточные методы секвенирования по эпигенетике

https://en.wikipedia.org/wiki/Single_cell_epigenomics