Гостьова лекція на тему:�«Клони та химери»,�Частина I

Доктор технічних наук за спеціальністю 05.11.17 – біологічні та медичні прилади та системи, професор кафедри електромеханіки, робототехніки, біомедичної інженерії та електротехніки Державного біотехнологічного університету, м Харків

Шигимага Віктор Олександрович

Вступ

Природне клонування поширене у живій природі серед рослин та тварин. Проте науково-практичний інтерес викликає штучне клонування багатоклітинних організмів. Експерименти в цьому напрямку розпочато, зокрема, з тваринами відносно недавно, лише близько 90 років тому. Спочатку вдалося клонувати земноводних, потім ссавців і в даний час клонування стало досить рутинним процесом і навіть набуло великого комерційного і особливо біомедичного значення. Саме останні досягнення штучного клонування ссавців є предметом суперечок та розбіжностей фахових науковців, а також основним змістом цієї доповіді.

Крім того, коротко розглянемо деякі аспекти химеризації з використанням клонування, а також отримання трансгенних тварин та перспективи цих технологій.

В теперішній час біотехнологічні продукти складають вже майже третину всіх продуктів і товарів у світі

3

КЛОНУВАННЯ

• у загальному випадку – це точне відтворення будь-якого об'єкта необхідну кількість разів.

​

• в біотехнології - одержання множини генетично ідентичних біооб'єктів (копій організмів) шляхом безстатевого розмноження.

Клонування буває двох видів

Репродуктивне

Повне

(соматичне або ембріональне)

• відтворюється весь організм цілком

​

​

• тиражування с/г тварин із необхідними виробничими показниками
• комерційне клонування тварин (спорт, дом.)
• відновлення зниклих або збереження рідкісних видів
• як допоміжний або проміжний етап

Заголовок презентации

4

Терапевтичне

Часткове

(використовуються зазвичай стовбурові клітини)

• відтворюються окремі тканини або органи

​

​

• компенсація дефектів власних тканин організму (без відторгнення при трансплантації)

​

клітинна терапія

Клонування тварин

5

Клонування тварин (коротка історія)

НА СЬОГОДНІ КЛОНОВАНО ПОНАД 25 ВИДІВ ТВАРИН

​

6

Останнім часом клоновані : 2023 – тибетська корова, 2024 – перуанський кінь

Комерційне клонування

З 2000-х рр. розвивається комерційне клонування домашніх та сільськогосподарських тварин.

​

7

Клонування коштує дорого. У 2015 р. у Південній Кореї брали за клонування собаки близько 100 тисяч доларів, а в США вдвічі менше. У Китаї клонування собаки у 2020 році коштувало 54 тисячі доларів.

У Китаї клоновано поліцейського песика Куньсюнь, якого почали тренувати у 2019 р.

Тепер клонують скакових коней. У Техасі одна з компаній до 2020 року відтворила 25 клонів кобили Айкен Кура, один з яких продала за 800 тисяч доларів.

Клонують ВРХ також для виробництва дорогого м'яса. У 2015 р. у Китаї почали будувати фабрику з виробництва преміальної яловичини з клонованих корів. У 2018 р. управління з санітарного нагляду за якістю харчових продуктів та медикаментів США дозволило продаж м'яса та молока від клонованих тварин.

Клонування яванської макаки, �2018 р.

8

У 2018 р. китайські вчені вперше повідомили про успішне клонування мавп за методом вівці Доллі. Дитинчат назвали Чжун Чжун та Хуа Хуа.

​

Суть методу полягала в наступному: брали яйцеклітину мавпи, витягали з неї ядро ​​та замінювали його ядром соматичної клітини.

​

Реконструйований ооцит розвивався в ембріон, який потім пересаджували до сурогатної матері. Надалі та народжувала клонів, тобто застосовувалась процедура соматичного клонування.

КЛОНУВАННЯ ЯВАНСКОЇ МАКАКИ, 2018 Р.

Клонування мавп�

У Китаї народилося п'ять клонів макаки із зміненими генами (клонування + трансгенез), 2019 р.

• Суть методу була така сама, як і при клонуванні яванських макак, тобто. застосовувалося соматичне клонування.
• Однак перед цією процедурою вчені вивели генетично модифікованих макак.

• У журналі National Science Review вийшло відразу дві статті, присвячені роботі з геномом мавп.
• Перша описує поведінку генетично модифікованих макак з фенотипом порушення циркадного ритму.
• Друга присвячена успішному клонуванню цих приматів.
• Авторами обох статей були співробітники Інституту неврології Китайської академії наук.

9

Деякі подробиці процедури

1

• За допомогою інструмента редагування генів CRISPR-Cas9 вчені блокували експресію гена BMAL1 на стадії ембріона. Цей ген – основний регулятор циркадних ритмів. Його деактивація призводить до порушення циклів сну та неспання.

​

2

• Після народження такі мавпи виявляли цілий спектр розладів, спричинених порушеннями ритмів. Серед них — скорочення сну, підвищена активність у нічний час, загострена тривожність, депресія і навіть поведінка, що нагадує шизофренію.

​

3

• Потім за допомогою вже відпрацьованої технології дослідники клонували одну з цих мавп. Із 325 ембріонів вийшло лише п'ять клонів. У подальшому їх можна використовувати як модель для дослідження генетичних недуг людини.

​

10

Схема клонування коня Пржевальського, 2020 р.

11

Приклад врятування зниклих видів

Клонований кінь з Китаю готується�до скачок,�2023 р.��

12

Китайські біотехнологи успішно клонували скакового коня, привезеного з Німеччини. За процес клонування відповідала компанія SinoGene, яка раніше проводила успішні експерименти з клонування собак і вовків. Асоціація конярів КНР вже схвалила участь клону у майбутніх змаганнях.

Клонування відкриває перспективи у кінному спорті, дозволяючи знизити вартість розведення коней. Сьогодні ціна чистокровного коня, придатного для участі у міжнародних змаганнях, сягає кількох мільйонів доларів, тож далеко не кожен спортсмен може дозволити собі купити та утримувати хоча б одну тварину.

Протягом двох десятиліть багато країн практикують клонування коней і тепер до цього списку приєднався Китай.

Чжуан — клонований кінь

13

Китайський робот вперше повністю провів весь процес клонування�свиней, 2022 р.

У Китаї вперше реалізували автоматичний процес клонування, в жодному з етапів якого не брала участь людина.

Біотехнологи з університету Нанькай вперше клонували свиней за допомогою робота. Самка, яка брала участь у виношуванні клонованих ембріонів, 31 березня 2022 народила сімох здорових поросят породи ландрас. Кожен етап процесу клонування був автоматизований. На думку вчених, залучення роботів підвищує успішність клонування, адже їхні дії точніше і рідше ушкоджують клітини.

На сьогодні Китай є найбільшим споживачем свинини у світі, проте Пекін прагне стати незалежним від імпорту цього продукту, особливо у зв'язку з численними санкціями США та інших країн. До того ж, китайські породи свиней швидко вироджуються.

14

"Біо-робототехничні"�поросята-клони

15

Деякі подробиці роботизованого процесу клонування

1

• Використано найпоширеніший метод клонування – «пересадка ядра соматичної клітини». При цьому в без'ядерну яйцеклітину вводиться соматична клітина тварини, що клонується. Звичайна процедура включає безліч складних та трудомістких етапів, що вимагає участі кваліфікованого персоналу і тому не може стати більш масштабною.

2

• Кожен етап процесу був автоматизований. За словами вчених, використання роботів підвищує успішність клонування, тому що їхні дії більш точні та менш схильні до пошкодження клітин. Застосування роботизованої технології клонування підвищило успішність операції з 10% до 27,5%. Перші поросята, отримані в результаті клонування, придатні для подальшого розведення.

3

• В результаті тривалих досліджень (5 років) вдалося досягти повної автоматизації процесу. Робот має мікроскопічний зір, а за допомогою його розраховує деформацію клітин так, щоб прикладати мінімальну силу і не пошкодити ооцит під час енуклеації. Це підвищує точність клонування та успіх ембріонального розвитку.

16

У Китаї клонували арктичного вовка, 2022 р.

• Співробітники китайської компанії SinoGene та Харбінського полярного парку, розташованого на північному сході Китаю, вперше клонували мелвільського острівного або арктичного вовка (Canis lupus arctos). Це підвид звичайного вовка, який відрізняється світлим хутром та зустрічається на арктичних островах у Північній Америці та Гренландії. Перше щеня народилося 10.06.2022 р, а друге з'явиться на світ найближчими днями, повідомив генеральний директор компанії.

17

ВОВЧОНОК «ДОЛЛІ»

Деякі подробиці проекту

1

• Раніше SinoGene вперше у світі клонувала собаку із соматичної клітини. Цуценя бігля на прізвисько Лун Лун народилося 28 травня 2017 року. Причому Лун Лун став ще й першим генномодифікованим собакою. Пізніше вчені успішно здобули ще двох здорових клонованих цуценят.

2

• Проект із клонування арктичного вовка стартував у 2020 році. Соматичні клітини вчені отримали зі зразка шкіри самки дикого вовка, привезеної з Канади до Харбінського полярного парку, сурогатною матір'ю для вовченя став собака породи бігль.

​

3

• На думку дослідників, клонування дає надію на порятунок видів, що під загрозою зникнення або вже вимерли. Клітини, збережені за допомогою кріоконсервації, в майбутньому можна використовувати для клонування особин, які збережуть здатність до розмноження і зможуть мати потомство, яке нічим не відрізняється від звичайних.

​

18

Химеризація

19

• Химера – це організм, що складається з генетично неоднорідних клітин.

​

• У тварин організми, клітини яких походять від двох або більше зигот, називають химерами.

​

• Організми, що утворились в результаті об'єднання зародкових клітин бластомера з різними генотипами.

​

• Отримані в межах одного виду або між видами.

Вперше отримана "справжня" мавпа-химера, 10.11.2023 р.

20

Китайські дослідники реалізували процедуру отримання живої тварини (макаки-крабоядки) за допомогою стовбурових клітин і ембріона іншої особини того ж виду.

​

Це перший у світі химерний примат з великою часткою чужорідних клітин, отриманих шляхом живонародження.

​

На фото нижче видно органи тіла мавпи (кінчики пальців і очі), які флуоресцюють зеленим кольором - так само, як оригінальні стовбурові клітини, в які раніше був введений ген, що кодує зелений флуоресцентний білок (GFP), який вперше був виділений з медузи Aequorea victoria ще на початку 1960-х років японським вченим Осамою Шімомура.

ДИТИНЧА КРАБОЇДНОЇ МАКАКИ, ​​ОТРИМАНЕ ШЛЯХОМ ВВЕДЕННЯ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН В ЕМБРІОН ІНШОЇ ОСОБИ ТОГО Ж ВИДУ

Діаграма процесу��В якій показані клітини, що беруть участь в процесі химеризації, включаючи те, як утворюється рання бластоциста, що дозволяє плоду розвиватися в химерну мавпу�причому, "світяться" ЕС-клітини, які "вбудувались" в тіло химери.

21

Деякі подробиці процедури химеризації

1

• Кілька років тому вчені вже привносили невелику частину чужорідного генетичного матеріалу до зразків та отримували з них повноцінних особин. Але цього разу команда дослідників з Китайської академії наук виростила організм із дуже великою (більше половини) часткою генів від іншої особини.

2

• Стовбурові клітини семиденного ембріона макакі-крабоєда запровадили іншому п'ятиденному ембріону того ж виду. Обидва організми не були родичами один одному. Пізніше сурогатна самка мавпи народила повністю сформоване дитинча-самця.

​

3

• Введені стовбурові клітини сформували 92% мозкової тканини та загалом склали 67% організму химери. Ці показники допоміг визначити флуоресцентний білок зеленого кольору, що вчені використовували для фарбування ЕС-клітин.

22

Подробиці процедури та публікація результатів

4

• Після народження дитинча дослідники побачили, що зелені клітини розкидані по всьому його тілу: наприклад, вони були чітко видні на кінчиках пальців, в очах. Аналіз показав, що донорські клітини були присутні в різних тканинах химери, утворюючи від 21 до 92 % цих структур.

​

5

• У результаті 40 ембріонів були імплантовані в тіла самок макак-крабоєдів, вийшло 12 вагітностей, шість із них призвели до живородження. І тільки в одному випадку на світ з'явилося дитинча-химера. На жаль, він прожив лише десять днів — ветеринари приспали його через дихальну недостатність та гіпотермію.

6

• Результати дослідження опубликовані в науковому журналі Cell, коротко про нього пише CNN. Серед авторів наукової статті - Мігель А. Естебан з Китайської академії наук та некомерційного підрозділу BGI-Research Hangzhou китайської генетичної фірми BGI, а також Лю Чжень з Китайської академії наук, Інституту нейронаук та інших організацій.

23

Перспективи використання химер

1

• Вчені сподіваються, що їх дослідження може бути корисним для моделювання нейродегенеративних захворювань (у мозку макакі-химери виявили багато впроваджених стовбурових клітин), а також допоможе збереженню видів, що зникають.

24

• У виданні також нагадали, що першу мишу-химеру створили ще у 1960-х роках. На таких організмах вчені вивчили, як взаємодіють здорові клітини та модифіковані, що корисно для розуміння біологічних процесів та багатьох хвороб.

2

3

• Однак фізіологія мишей сильно відрізняється від людської, тому досліди на мишах не відтворюють багатьох аспектів людських захворювань, вважає Лю Чжень.

Перспективи використання химер

4

• Ведуться суперечки навколо створення химер, у яких є людські клітини та клітини представників інших видів. Проте вчені повідомляли про створення таких організмів. У CNN нагадали про створення в 2020 році ембріона миші, в якому 4% клітин були людськими. У 2021 році фахівці отримали ембріон-химеру людини та мавпи.
• Один із перспективних напрямів у химеризації – отримання органів у тварин-трансгенів для трансплантації людям.

5

• Вчені сподіваються, що одного разу такі "частково людські химери допоможуть задовольнити попит на трансплантацію органів".
• Однак на брифінгу, присвяченому новому дослідженню, додають у публікації, Лю Чжень заявив, що спроба створення химери мавпи та людини поза ранніми ембріональними стадіями переходить етичну червону межу.

25

Заключення

• Найбільшу увагу вчених та громадськості привертає клонування багатоклітинних організмів, що стало можливим завдяки успіхам генної інженерії. Створюючи особливі умови і втручаючись у структуру ядра клітини, фахівці змушують її розвиватися у потрібну тканину чи навіть цілий організм. Допускається можливість відтворення навіть померлого організму за умови кріоконсервації його генетичного матеріалу.
• Однак сьогодні існує багато етичних перепон для подальшого розвитку клонування, особливо щодо людини. Деякі світові релігії вважають клонування людини категорично неприпустимим. У багатьох країнах клонування людини взагалі заборонено. У частині країн заборонено репродуктивне клонування, у якому відтворюється цілий багатоклітинний організм.
• Але прогрес науки зупинити неможливо і рано чи пізно основні проблеми та труднощі будуть вирішені і клонування знайде своє гідне місце у плеяді сучасних біомедичних методів та технологій на службі у людства.

Висновки��

27

1. Клонування давно стало практично рутинним біотехнологічним процесом і широко застосовується для розведення тварин вже не тільки у с/г виробництві, а й в інших сферах, наприклад, кінному спорті, відновленні зниклих видів. Крім того, клонування також широко застосовується як не цільовий, а допоміжний процес, наприклад, при химеризації, трансгенезі і т.п.

2. Химеризація, на відміну від клонування, перебуває ще на стадії активної розробки, удосконалення методики та технічних засобів. Тим не менш, успіхи в отриманні химер людина-тварина дозволяють очікувати у найближчі 3-5 років великих досягнень, зокрема у трансплантології.

ХИМЕРИ В ПРИРОДІ

Успіхи у виведенні трансгенних тварин �(додаткова інформація)

БІОТЕХНОЛОГІЯ –

Тому:

У біотехнологічних процесах використовуються:

​

• Мікро- та макро- організми
• Рослинні клітини
• Тваринні клітини
• Частини клітин: клітинні мембрани, рибосоми, мітохондрії, хлоропласти, ядро.
• Біологічні макромолекули: ДНК, РНК, білки (найчастіше ферменти)

І не тільки….

Комплекс методів та технічних засобів щодо використання біооб'єктів для отримання різних продуктів, організмів або здійснення цільових перетворень сировини у технологічних процесах

ТРАНСГЕННІ РИБИ

29

У 1980-х роках. співробітники фірми "AquaBounty" (Массачусетс, США) ввели в ікринки атлантичного лосося конструкцію з "антифризного" гена бельдюги та зміненого гена гормону росту лосося - вони синтезували надлишок гормону росту і працювали цілий рік, а не тільки в теплі місяці.

Пізніше було виведено гігантські форелі, тіляпії, палтуси та інші риби.

За рік трансгенні лососі

(а) виростають в 4 - 5 разів більше звичайних,

тіляпії (b) в 1,5 - 2 рази більше звичайних

�Створені трансгенні корови, у молоці яких міститься людський білок лактоферрин, необхідний харчування грудних дітей, хворих і ослаблених людей.��У літрі молока звичайної корови міститься 0,02 г лактоферину. У літрі молока корів корпорації Gene Farm - 1 грам людського лактоферину. Всі вони – нащадки бика на прізвисько Герман, який народився 1990 року в Голландії.�

ТРАНСГЕННА ВЕЛИКА

РОГАТА

ХУДОБА

30

На початку 90-х років в Інституті біології гена РАН створено овець з геном хімозину з ВРХ. 1999 року почалося промислове виробництво хімозину з молока трансгенних овець. Собівартість у 4-5 разів нижча, ніж при отриманні із сичугів забитих молочних телят.�Від однієї вівці за сезон можна отримати достатньо ферменту, щоби приготувати 30 тон сиру. Для процесу сироваріння хімозин можна не виділяти, а просто залити 50 тон молока ВРХ кількома літрами овечого молока та перемішати.

ТРАНСГЕННІ ВІВЦІ

​

31

У світі ведуться роботи з виведення трансгенних кіз та корів, у молоці яких міститься велика кількість інсуліну, соматотропіну та інших біологічних сполук, необхідних для терапевтичних цілей та харчування.�Вчені також створили трансгенних кіз, які дають молоко з людським білком лактоферрином.

ТРАНСЕННІ

КОЗИ

​

32

Лактоферрин - білок, яким материнське молоко замінює новонародженому немовляті імунітет. Він захищає від хвороб, стресів, холоду та спеки – від усього, що може зашкодити малюку. А при зустрічі з інфекціями працює як природний антибіотик, знищуючи бактерії, віруси та грибки. Діти, які перебувають на штучному вигодовуванні, лактоферин не отримують, тому частіше хворіють і серед них значно вища захворюваність і смертність. Щоб допомогти їм, можна використати донорське молоко, але його мало, до того ж воно може бути джерелом небезпечних вірусів та бактерій, тому його використання як джерело лактоферину заборонено. Але лактоферрин потрібен дітям, він ефективний й у лікуванні онкологічних та багатьох інших захворювань. Невипадково один його грам на світовому ринку коштує до 3000 $. У багатьох країнах світу вже вивели трансгенних корів, чиє молоко містить людський лактоферин.

Фірма "Origen Therapeutics" (Каліфорнія) у курячих яйцях отримала антитіла до раку передміхурової залози людини. Протиракова активність цих антитіл виявилася в 10-100 разів більшою, ніж у антитіл, отриманих іншими методами.� Британська "Oxford Biomedica" у співпраці з американською компанією "Viragen" і Рослинським інститутом отримала в білку трансгенних яєць антитіла проти одного з видів раку шкіри - меланоми.

ТРАНСГЕННІ

КУРИ

​

Пташиний грип переможуть трансгенні кури

​

Ліворуч: Хелен Санг, керівник проекту з виведення грипостійкої породи курей. Справа: одна з учасниць експерименту (фото із сайту www.prnewswire.com)

34

В США було отримано свиней, що несуть ген соматотропіну (гормону зростання). На відміну від мишей, трансгенних по соматотропіну, свині не виросли вдвічі, але стали менш жирними і м'ясними. Трансгенні свині з вбудованим геном інсуліноподібного фактора були створені для вивчення ланцюга біохімічних перетворень інсуліну, а побічним ефектом виявилося зміцнення імунної системи свиней.

35

ТРАНСГЕННІ СВИНІ

​

​

​

ЛЮДЯМ БУДУТЬ ПЕРЕСАДЖУВАТИ ОРГАНИ

ГМО-СВИНЕЙ

​

​

НАШЕ МАЙБУТНЄ��1

36

• Китайські вчені винайшли новий метод, який має зробити революцію у медицині. Вони пропонують використовувати клонованих свиней для пересадки органів людям.
• Вченими Нанкінського медичного університету вдалося визначити ген, який відповідає за відторгнення органів тварин під час пересадки їх людям. Вони змінили ген і досягли того, що організм людини почав приймати органи. Зараз досліджують можливість відторгнення тканин за умови тривалого використання.
• Прогнози китайців дуже оптимістичні. За 5 років вони проведуть кілька клінічних досліджень нової методики. Планують спочатку протестувати рогівку ока та шкіру, потім перейдуть до дослідження операцій з пересадки нирок, печінки, серця.

НАШЕ МАЙБУТНЄ��2

• Нова методика зробить процедуру пересадки органів значно дешевшою. Наприклад, вартість отриманої від свині рогівки лише 1,5 тис. доларів.
• Клітини для клонування беруть у генетично модифікованих свиней. Планується виробляти кілька сотень тварин на рік. Поросята з'являються на світ за допомогою операції кесаревого розтину, відразу ізолюються від матерів і поміщаються в стерильне середовище. Постійно будуть проводитись карантинні перевірки для підтвердження якості органів.

ДЯКУЮ ЗА УВАГУ