​

​

ОДЕСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені І. І. МЕЧНИКОВА�Біологічний факультет�Кафедра мікробіології, вірусології та біотехнології

Синтез вторинних метаболітів у моно- та ко-культурах бактерій родів Bacillus та Pseudomonas, виділених з мідій Чорного моря

​

​

​

Керівник: д.б.н., професор

Філіпова Тетяна Олегівна

М. Рогалевський, магістр I курсу, М. Фіногенова, аспірант

Одеса 2024

Мета даної роботи – охарактеризувати ефективність синтезу вторинних метаболітів морськими бактеріями у моно- та ко-культурах і порівняти їх протипухлинну активність

1. Порівняти вихід цільових продуктів за різних умов культивування досліджуваних бактерій: моно- та ко-культивування, використання синтетичної та природної морської води.
2. Оцінити внесок кожного зі змінних факторів в ефективність синтезу вторинних метаболітів морськими бактеріями.
3. Порівняти біологічну активність вторинних метаболітів монокультур B. subtilis МС3, P. аeruginosa М1 та їх консорціуму (МС3+М1).

Завдання роботи

2

Актуальність теми. Галузі використання вторинних метаболітів.

Вторинні метаболіти морських бактерій

Медицина

Біоремедація

Хімічні технології

3

Основні методи оптимізації синтезу вторинних метаболітів

4

Були використані штами грам-негативних та грам-позитивних бактерій, які були виділені з мідій Одеської затоки Чорного моря.

Грам-негативні бактерії:

• три штами Pseudomonas аeruginosa (М1, М3, М4);
• один штам Alcaligenes faecalis.

Грам-позитивні бактерії:

• Bacillus subtilis МС3;
• Bacillus atrophoeus МН4.

​

Штами бактерій

Матеріали та методи дослідження

5

Матеріали та методи дослідження

Умови культивування

Культивування проводили у скляних колбах об’ємом 300 мл, що містили по 120 мл поживного середовища.

Посівна доза бактерій становила 6 мл добової культури з оптичною густиною 0,2 при 540 нм.

Культивування проводили при 30 °C протягом 5 діб в умовах перемішування при 150 об/хв. Через 5 діб спектрофотометрично визначали кількість клітин у кожному варіанті і центрифугували культури 20 хв при 12000 об/хв для одержання безклітинних супернатантів.

Як базове застосовували середовище LB наступного складу, г/л:

• пептон – 15;
• дріжджовий екстракт – 10;
• NaCl – 5;
• дистильована вода – 1 л.

6

Розробили два модифікованих середовища:

​

Модифіковане середовище 1: додали до базового середовища додаткових солей, г/л:

MgCl2 × 6H2O – 11; Na2SO4 – 4; CaCl2 × 6H2O – 2; KCl – 2; KBr – 0,7; H3BO3 – 0,1; NaF – 0,03 мг/л; NH4NO3 – 3 мг/л; Fe(III)PO4 × 4H2O – 1 мг/л.

Модифіковане середовище 2: замінили дистильовану воду на морську.

​

​

Модифікація складу поживного середовища

Матеріали та методи дослідження

7

Склад подвійних консорціумів морських бактерій

8

Матеріали та методи дослідження

Екстракцію вторинних метаболітів здійснювали етилацетатом з безклітинних супернатантів культур.

З безклітинних екстрактів відбирали по 100 мл супернатантів та додавали до них по 100 мл етилацетату та інтенсивно струшували. Після розшарування водного та етилацетатного шарів органічну фазу відбирали у чисті колби. Водний шар екстрагували ще двічі тим самим об’ємом етилацетату.

Усі порції розчинника з одного зразка об’єднували та випарювали етилацетат при 40 ˚С до об’єму 2 мл, який переносили у попередньо зважені на аналітичних вагах поліетиленові пробірки епендорф з пробками. Далі випарювання залишків етилацетату, пробірки знов зважували та по різниці маси чистих пробірок та пробірок з вторинними метаболітами визначали масу останніх. Після цього пробірки щільно закривали пробками та зберігали у холодильнику при -20 ˚С.

Методи екстракції вторинних метаболітів та визначення їх маси

9

Вміст вторинних метаболітів у монокультурах досліджуваних морських бактерій за культивування у різних середовищах

1

1

Вміст вторинних метаболітів у ко-культурах грам-негативних бактерій з Bacillus subtilis МС3

2

1

Вміст вторинних метаболітів у ко-культурах грам-негативних бактерій з Bacillus atrophoeus МН4

3

1

У деяких ко-культурах поява нових вторинних метаболітів була зафіксована візуально, за змінами кольору

3

1

Порівняння розрахункового та зафіксованого вмісту вторинних метаболітів у ко-культурах грам-негативних бактерій з B. subtilis МС3

Зіставляли між собою результати, отримані за культивування консорціумів бактерій у середовищах LB, приготованих на дистильованій (контроль) та морській воді.

Примітка:

1. МС3 + A. faecalis;
2. МС3+М1;
3. МС3+М3;
4. МС3+М4.

4

1

Порівняння розрахункового та зафіксованого вмісту вторинних метаболітів у ко-культурах грам-негативних бактерій з B. atrophoeus МН4

Зіставляли між собою результати, отримані за культивування консорціумів бактерій у середовищах LB, приготованих на дистильованій (контроль) та морській воді.

Примітка:

1. МС3 + A. faecalis;
2. МС3+М1;
3. МС3+М3;
4. МС3+М4.

5

1

Визначення протипухлинної активності отриманих вторинних метаболітів

Ріст клітин НСС у планшетах за впливу вторинних метаболітів моно- та ко-культури B. subtilis МС3 та P. аeruginosa М1 (48 годин інкубації, забарвлення кристалічним фіолетовим).

6

1

HCC – гепатоцелюларна карцинома

Визначення протипухлинної активності отриманих вторинних метаболітів

Мікрофотографії клітин НСС у лунках планшету за впливу вторинних метаболітів моно- та ко-культури B. subtilis МС3 та P. аeruginosa М1 (Nikon 400).

7

1

ВИСНОВКИ

1. Одержано 42 зразки вторинних метаболітів досліджуваних морських бактерій.
2. Встановлено, що найбільшу кількість цільових продуктів синтезують консорціуми B. subtilis МС3 з P. аeruginosa М1 та М4 за присутності у поживному середовищі морської води.
3. Використання синтетичної морської води фактично не впливало на кількість вторинних метаболітів.
4. Оцінка протипухлинної активності вторинних метаболітів монокультур.
5. B. subtilis МС3 з P. аeruginosa М1 та їх консорціуму (МС3+М1) довела, що продукти саме ко-культури володіють найвищою антипроліферативною дією.

8

1

ДЯКУЮ ЗА УВАГУ!