CỐ ĐỊNH MẪU

MỤC ĐÍCH

• Cố định là phòng ngừa sự thoái hóa của tế bào và mô bởi những enzym ly giải có sẵn, nhằm đảm bảo hình dạng gần nhất với trạng thái sống của tế bào.
• Chất cố định thay đổi trạng thái vật lí, hóa học của tế bào và quyết định phương pháp nhuộm.

PHÂN LOẠI

• Cố định ướt (nhuộm bằng phương pháp Papanicolaou).
• Cố định khô (nhuộm bằng phương pháp MayGrünwald-Giemsa hoặc Diff Quik).

​

CỐ ĐỊNH ƯỚT

• CỐ ĐỊNH THƯỜNG QUI

​

• CỐ ĐỊNH BAO PHỦ

​

• CỐ ĐỊNH CHO MỤC ĐÍCH ĐẶC BIỆT.

​

​

CỐ ĐỊNH THƯỜNG QUI

• Đây là phương pháp lý tưởng cho việc cố định tế bào cổ tử cung hay các mẫu phết khác.

​

CHẤT CỐ ĐỊNH THƯỜNG QUI

• Cồn 95% (Ethanol): trong hầu hết các phòng thí nghiệm. Ethanol tuyệt đối (100%) cũng có thể sử dụng, nhưng đắt tiền hơn nhiều.
• Methanol100%: là một thay thế chấp nhận được cho ethanol 95%. Methanol ít bay hơi hơn, nhưng có giá thành cao hơn so với ethanol.

​

​

CHẤT CỐ ĐỊNH THƯỜNG QUI

• Hỗn hợp ethanol - Ether: chất cố định này được Papanicolaou đề xuất sử dụng đầu tiên. không được sử dụng trong hầu hết các phòng thí nghiệm, vì là chất nguy hiểm, có mùi và bản chất hút ẩm.
• Propanol và isopropanol 80% : Propanol và isopropanol gây co rút tế bào chút ít so với ether- ethanol hoặc methanol. Bằng cách sử dụng tỷ lệ thấp hơn ethanol sẽ giảm sự co rút các tế bào. Do đó propanol 80% là một thay thế cho 95% ethanol.

​

​

CHẤT CỐ ĐỊNH THƯỜNG QUI

• Ethanol biến tính: Đó là ethanol đã được thay đổi bằng việc bổ sung các chất phụ gia; tất cả chúng chứa ethanol là thành phần chính, ethanol nồng độ 95% hoặc 100%.
• Ví dụ: 90% ethanol 95%+5 % methanol + 5 % isopropanol.

​

THỜI GIAN CỐ ĐỊNH

• Thời gian cố định tối thiểu 15-30 phút trước khi nhuộm.
• Kéo dài cố định trong vài ngày hoặc thậm chí vài tuần sẽ không ảnh hưởng đến hình thái của các tế bào.
• Nếu mẫu được bảo quản trong ethanol một thời gian dài, tốt hơn là bảo quản chúng trong tủ lạnh.

​

CỐ ĐỊNH BAO PHỦ

• Cách cố định này thay thế cho cố định ướt. Phun keo hay nhỏ dịch bảo quản.
• Ví dụ: cố định Carbowax (Polyethylene Glycol) hay cố định Diaphine (keo xịt tóc Hairspray).

​

CỐ ĐỊNH BAO PHỦ

• Cố định khô, rất thuận tiện cho việc bảo quản, vận chuyển xa với số lượng lớn.
• Phun ngay sau khi phết mẫu, với khoảng cách phun từ bình xịt tới lam tối ưu là 12 inches (25-30 cm). Phun phủ đều lên lam.
• Trước khi nhuộm phải ngâm lam phết trong cồn 95% để loại bỏ keo phủ, tốt nhất là qua đêm.

​

CHẤT CỐ ĐỊNH ĐẶC BIỆT

• Chất cố định Carnoy: Đây là một chất cố định đặc biệt cho mẫu phết huyết học. Các axit axetic trong thành phần chất cố định, làm tiêu hồng cầu. Nếu cố định quá mức dẫn đến mất việc vật chất nhiễm sắc.

● Chất cố định AAF : Đây là dung dịch cố định lý tưởng được sử dụng cho dịch ly tâm làm cellblock.

​

CỐ ĐỊNH KHÔ

• Để khô tự nhiên trong không khí.
• Yêu cầu: Kỹ thuật phết phải thuần thục để có 1 phết tế bào mỏng và đều
• Cố định đúng: cố định ướt bằng ethanol 95% phải được tiến hành ngay tức khắc, trong khoảng thời gian 10-15 phút; nếu cố định ướt chậm, tế bào bị khô sẽ tăng kích thước một cách giả tạo. Ngược lại, cố định khô cũng phải nhanh chóng trong vòng 10 giây, muốn vậy phết tế bào phải mỏng và đều; nếu cố định khô chậm, tế bào và nhân sẽ bị co nhỏ lại một cách giả tạo.

CỐ ĐỊNH KHÔ

• Cố định đúng: cố định ướt bằng ethanol 95% phải được tiến hành ngay tức khắc, trong khoảng thời gian 10-15 phút; nếu cố định ướt chậm, tế bào bị khô sẽ tăng kích thước một cách giả tạo.
• Ngược lại, cố định khô cũng phải nhanh chóng trong vòng 10 giây, muốn vậy phết tế bào phải mỏng và đều; nếu cố định khô chậm, tế bào và nhân sẽ bị co nhỏ lại một cách giả tạo.

CỐ ĐỊNH CHO VẬN CHUYỂN MẪU

• Phương pháp phủ Glycerine lên lam: Mẫu phết đầu tiên được cố định trong 95% ethanol 12 phút và để khô.
• Nhỏ hai giọt glycerine phủ lên lam kính. Có thể gói lại gửi đến phòng thí nghiệm .
• Phủ cố định bằng carbowax và phun keo cũng rất thuận tiện.

​

TIỀN CỐ ĐỊNH

• Tiền cố định có thể bảo quản một số mẫu nhiều ngày ngăn chặn sự thoái hóa của tế bào.
• Nhược điểm: sự đông kết của protein và ngưng tụ của nhiễm sắc thể các tế bào kết cụm lại làm khó kết dính với lam kính.
• Các chất tiền cố định được sử dụng:

●Ethyl alcohol (50% dd)

●Sacomanno’s fixative (50% alcohol with 2% Carbovax 1540)

KỸ THUẬT TẬP TRUNG TẾ BÀO

Nếu mẫu bệnh phẩm có nhầy cần làm tan nhày.

Để lắng cặn tự nhiên nếu có thời gian.

- Cho mẫu vào máy ly tâm với tốc độ 2000 vòng/phút x10 phút.

- Gạn bỏ phần trong bên trên, để lại vài giọt cùng phần lắng cặn tế bào bên dưới (1-2ml).

- Lấy phần cặn lắc trên máy trộn điện 4-5 giây rồi lấy làm phiến đồ.

​

CHÚ Ý

• Dịch nhiều hồng cầu (Đỏ), cố định bằng Carnoy để ly giải hồng cầu trong dịch xuất huyết. Hoặc dung axit acetic.
• Nếu số lượng của chất lỏng là quá ít cho ly tâm, thêm nước muối sinh lý trước khi ly tâm.

​

​

​

CHÚ Ý

• Nếu có cục máu đông, các cục máu đông lớn có thể được xử lý như cellblock.
• Nhỏ 1-2 giọt dịch ly tâm lên lam và áp 2 lam kéo nhẹ ngược chiều, sao cho mẫu được dàn điều trên lam.

​

​

​

KỸ THUẬT CELLBLOCK

NGUYÊN LÝ

• Nhằm tập trung các tế bào đơn lẻ, rải rác trong dịch thành một khối có thể đưa vào chuyển, đúc, cắt nhuộm giống qui trình mô học thường qui.

BỆNH PHẨM

FNA

ĐÀM

DỊCH TRÀN

NƯỚC TIỂU

DỊCH RỬA

TIẾN HÀNH KĨ THUẬT

• + Bước 1: Cho các ống nghiệm chứa dịch vào máy ly tâm trong 10 phút với tốc độ 2.000 vòng/phút.
• + Bước 2: Loại bỏ lớp dịch trong phía trên để lấy lắng cặn tế bào rồi cố định cặn tế bào trong formol đệm trung tính 10% trong tủ ấm 60oC, khoảng 2 giờ.
• + Bước 3: Ly tâm bệnh phẩm lần nữa với tốc độ 2000 vòng/phút trong 10 phút nếu cần (nếu bệnh phẩm đã hình thành khối chắc thì qui trình có thể chuyển trực tiếp từ bước 2 sang bước 4).
• + Bước 4: Loại bỏ formol trong ống vào lọ đựng nước thải.

​

TIẾN HÀNH KĨ THUẬT

• + Bước 1: Cho các ống nghiệm chứa dịch vào máy ly tâm 2.000 vòng/phút-10 phút
• + Bước 2: Loại bỏ lớp dịch trong phía trên để lấy lắng cặn tế bào rồi cố định cặn tế bào trong formol đệm trung tính 10% trong tủ ấm 60oC, khoảng 2 giờ.

TIẾN HÀNH KĨ THUẬT

• + Bước 3: Ly tâm bệnh phẩm 2000 vòng/phút-10 phút nếu cần (nếu bệnh phẩm đã hình thành khối chắc thì qui trình có thể chuyển trực tiếp từ bước 2 sang bước 4).
• + Bước 4: Loại bỏ formol trong ống vào lọ đựng nước thải.

​

TIẾN HÀNH KỸ THUẬT

• + Bước 5: Dùng que gỗ nhỏ để lấy khối tế bào ra khỏi ống và đặt lên một tờ giấy (loại giấy không dính có trong phòng xét nghiệm mô bệnh học). Gói khối tế bào trong giấy này và đặt vào trong khuôn nhựa đã được dán nhãn với tên và mã số người bệnh.
• + Bước 6: Cho khuôn nhựa có chứa khối tế bào tiếp tục được thực hiện các bước như vào qui trình mô học thường qui.

KẾT QUẢ

• Khối tế bào lưu giữ được các loại tế bào và gợi lại một phần cấu trúc mô tốt hơn so với phiến đồ, cho phép cắt được nhiều mảnh cắt giống nhau
• Nhuộm HE, nhuộm đặc biệt và nhuộm hóa mô miễn dịch cho phép chẩn đoán xác định được nhiều loại tổn thương như nấm, tổn thương ác tính hoặc định hướng nguồn gốc của các u nguyên phát.

CHÚ Ý

• Trong quá trình làm kỹ thuật có thể bị nhầm lẫn bệnh phẩm do qui trình gồm nhiều bước, rơi vỡ ống xét nghiệm làm mất bệnh phẩm… Cần phải làm việc tập trung, luôn luôn có sự kiểm tra, đối chiếu để tránh những sai sót không đáng có.