Herramientas de Biología Molecular para el diagnóstico de Enfermedades

Prof. José Antonio Nastasi Catanese

DESNATURALIZACION.- La ruptura de los puentes de hidrógeno que mantienen unida la doble cadena de un ácido nucleico, dando origen a dos cadenas simples, complementarias entre sí, pero separadas. Usualmente la ruptura de la doble cadena se basa en el uso de calor, elevación de pH, modificaciones de la fuerza iónica del medio o una combinación de esos factores.

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RENATURALIZACION.- El proceso inverso a la desnaturalización.

HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR

HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR

Hibridación.- La unión entre dos moléculas simples “single stranded” a traves de puentes de hidrógeno entre bases complementarias (A-T;C-G) para formar una molécula doble “doble stranded”. La unión puede ser entre ADN-ADN; ADN-ARN; ARN-ARN. La estabillidad de la doble molécula formada dependerá de la perfección de la complementaridad entre las bases de las dos cadenas. La rapidez y precisión de la formación de la doble cadena dependerá de la concentración de las cadenas simples y de las condiciones del medio (pH; Fuerza iónica, etc.)

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION.- Enzimas de origen bacteriano, que reconocen secuencias específicas en el ADN, usualmente “secuencias palindrómicas” y lo cortan a ese nivel. Pueden dar origen o no a “extremos pegajosos”. Por ejemplo, EcoRI es una enzima aislada a partir de Escherichia coli que reconoce la secuencia 5’-GAATTC-3’ y corta ambas “hebras” del ADN entre los nucleótidos G y A.

HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR

Enzimas de Restricción

EcorRI

1

2

3

4

5

6

---G A A T T C---

---C T T A A G---

A A T T C---

---G G---

---C T T A A

EcorRI

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

5

6

EcorRI

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

5

6

GAATAC

CT TATG

5+6

VECTOR.- Una molécula de ADN que se puede replicar de forma autónoma en un huesped (bacteria o levadura), del cual puede ser posteriormente aislada en forma pura. En su molécula se puede insertar otras moléculas de ADN de origen distinto al del vector y replicar asi abundantemente dicha molécula “extraña”. Los vectores pueden ser: Plásmidos, Fagos, Cósmidos, YACS, etc.

HUESPED.- El organismo que se usa para mantener y propagar una molécula de ADN recombinante. Usualmente una bacteria (Escherichia coli) o una levadura (Sacaromyces cerevisiae).

HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR

Vectores

CLONE.- Una molécula de ADN recombinante, usualmente un vector, que contiene un gene u otra secuencia de interés.

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CLONAR.- Generar un clone.

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BIBLIOTECA GENOMICA.- Una colección de clones que contienen gran parte o todo el genoma de una célula, tejido o cromosoma original. Ejemplo. Una biblioteca de “DNAg humana” , Una biblioteca de ” genoma humano”.

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HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR

Clonación Molecular

SONDA.- Una molécula de ADN o ARN, natural o sintética de secuencia conocida o no, “marcada” con sustancias radioactivas, fluorescentes o enzimáticas, usada para detectar su secuencia complementaria por hibridización molecular.

HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR

Detección de Mutaciones

TERMINOS Y HERRAMIENTAS DE GENETICA MOLECULAR

SOUTHERN BLOT.- Técnica para transferir ADN desde un gel de Agarosa o poliacrilamida a una membrana, usualmente de Nylon, a fin de poder utilizar dicho ADN en procesos de desnaturalización, hibridización y renaturalización que serían imposibles de realizar en los geles.

Muestra de ADN

Procedimientos de Blotting

TECNICAS Y HERRAMIENTAS DE GENETICA MOLECULAR

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA.- Técnica que permite la amplificación de un determinado segmento de ADN. El segmento especificado es copiado repetidas veces y a partir de una sola molécula original pueden obtenerse millones de copias al final de la reacción.

PCR

PCR

PCR

2³⁰=1.073.741.824

TERMINOS Y HERRAMIENTAS DE GENETICA MOLECULAR

SECUENCIACION DE ADN.- Técnicas que permiten determinar la secuencia nucleotídica de una molécula de ADN. Desarrolladas independientemente por Walter Gilbert y Fred Sanger , quienes compartieron el premio Nobel en 1980 por su descubrimiento.

Secuenciación del ADN

Un agente químico destruye una o dos bases de el total de cuatro bases nitrogenadas

MÉTODO DE MAXAM Y GILBERT

Secuenciación del ADN

Se colocan en el termociclador, luego se separan con una electroforesis de ácidos nucleicos.

MÉTODO DE SANGER

HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR

Electroforesis de ácidos nucleicos.- Migración de moléculas de ácidos nucleicos en un campo eléctrico y en un medio (Agarosa o poliacrilamida) que los separa de acuerdo a su tamaño (Peso molecular)

APLICACIONES DE LA HERRAMIENTAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

• MAPEO DE GENES
• DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
• GENÉTICAS
• MICROBIANAS
• SUSCEPTIBILIDADES A ENFEREMEDADES
• PROYECTO GENOMA HUMANO (HUGO)
• IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS
• TERAPIA GÉNICA
• CLONACIÓN
• MOLECULAR
• INDIVIDUAL
• ANIMALES TRANSGENICOS.

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Detección de Mutaciones

Detección de Mutaciones

Detección de Mutaciones

Aplicaciones: Medicina Forense

15

18

20

23

Madre Padre Hijo

Exclusión

15

18

20

Madre Padre Hijo

Inclusión

Aplicaciones: Medicina Forense

13

16

21

23

Víctima Semen Sangre Piel Victimario

Inclusión

13

16

21

23

Víctima Semen Sangre Piel Victimario

Exclusión

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Proyecto Genoma

Genomas Secuenciados para Septiembre de 1997.

Aplicaciones: Diagnóstico de microorganismos.

Tomado de cualquier

tejido corporal

Primers Específicos

para el agente

Amplifica millones de veces el ADN o ARN viral, siendo, posteriormente detectado muy fácil y rápidamente. Incluso simultáneamente se puede detectar el serotipo o cualquier variante del virus.

27 de febrero SE CLONO AL PRIMER MAMÍFERO

DOLLY

CLONACIÓN

Los cinco primeros cerdos clonados

CLONACIÓN

CLONACIÓN

Animales y vegetales transgénicos.

Susceptibilidad genética