​

​

Микроорганизмдер физиологиясы (тыныс алу, көбею).�Микробиологиялық зерттеу әдісі: аэробтар мен анаэробтардың таза культурасын бөліп алу, микроб түрін анықтау принциптері.

​

​

​

​

Дәріскер:�PhD, доцент Болатхан К.�

����������-

Энергетикалық метаболизм түрлері.

Микроорганизмдердің тыныс алуы. Анаэробты жағдай жасау тәсілдері.�Микроорганизмдердің көбеюі, бактериялардың өсу фазалары, өсуін бағалау.

Таза культураны бөліп алу (кезеңдері, идентификация параметрлері).

Құрылыстық (конструктивті) метаболизм

Жасушаның барлық құрамдас бөліктері (аминқышқылдар, нуклеотидтер, майлар, көмірсулар) аминқышқылдардан, фосфаттардан, қанттардан, пуриндік және пиримидиндік негіздерден, органикалық қышқылдардан полимерлену реакциялары арқылы түзіледі.�Бұл құрылыс блоктарының көзі – энергия алмасудың негізгі жолдарының аралық өнімдері болып табылады.

Энергетикалық метаболизм –

• Құрылыс процестері үшін энергия (Е) қажет.�Бактерия жасушасында энергия АТФ түрінде жиналады.
• Хемоорганотрофты бактерияларда энергия алу процестері – бұл тотығу-тотықсыздану реакциялары, олар фосфорлану реакцияларымен қатар жүреді.�Бұл реакциялар кезінде тотығатын көміртек (С) СО₂ түрінде бөлінеді.
• Осы реакциялар барысында бөлінетін сутекті (қалпына келген НАД түрінде) жою үшін әртүрлі бактериялар соңғы сутек (немесе электрон) акцепторының түріне байланысты әртүрлі тәсілдерді пайдаланады.

)

Энергия алу тәсіліне қарай бактерияларда метаболизмнің 3 түрі ажыратылады.

���Ферментация (немесе ашу) – бұл энергия алу процесі, онда субстраттан бөлінген сутек (Н) органикалық қосылыстарға беріледі.�Ашу процесіне оттегі қатыспайды.�Ашуға қабілетті заттар: көмірсулар, аминқышқылдары, пуриндер, пиримидиндер, көпатомды спирттер.�Ашуға қабілетсіз заттар: ароматты көмірсутектер, стероидтар, каротиноидтар және май қышқылдары.�

Көмірсулардың ашу түрлері(соңғы өнімдердің табиғатына байланысты)

• Спирттік ашу. Бұл ашу түрі ашытқыларға тән.�Соңғы өнімдері: этанол және көмірқышқыл газы (CO₂).

🥛 Сүтқышқылды ашу (2 түрі бар):

• Гомоферментативті түрі – бір ғана өнім түзіледі: сүт қышқылы.�Мысалдар: Enterococcus faecalis, Streptococcus salivarius, Lactobacillus bulgaricus, Lactococcus lactis.
• Гетероферментативті түрі – бірнеше өнім түзіледі: сүт және сірке қышқылдары, сонымен қатар қосымша өнімдер ретінде CO₂ және этанол түзілуі мүмкін.�Мысалдар: Lactobacillus, Bifidobacterium
• 🧪 Құмырсқа қышқылды ашу
• Нәтижесінде май, ацетон, сірке, капрон және басқа да органикалық қышқылдар түзіледі.�Мысал: анаэробты бактериялар.
• 🧫 Басқа ашу түрлері:
• Пропионқышқылды ашу – пропионобактерияларға тән;
• Майқышқылды ашу – клостридияларға тән;
• Сіркеқышқылды ашу – сіркеқышқылды бактерияларға тән.

​

​

​

Тыныс алу – биологиялық тотығу актісі ретінде

Тыныс алу (немесе биологиялық тотығу) — бұл тотықтыру-тотықсыздану реакцияларымен қатар жүретін тотығу фосфорлану реакцияларында энергия (E) алу процесі.�Бұл кезде электрон донорлары органикалық қосылыстар болуы мүмкін (органотрофтарда), немесе бейорганикалық қосылыстар (литотрофтарда),�ал электрон акцепторы тек бейорганикалық қосылыстар болып табылады.

�����Тотығу метаболизмі бар бактерияларда сутектің (H₂) акцепторы – молекулалық оттегі болып табылады, оған сутек көпферментті жүйе (тыныс алу тізбегі) арқылы тасымалданады.�Бұл жүйенің құрамына цитоплазмалық мембранада орналасқан ферменттер жатады.

����������-

Микроорганизмдердің тыныс алуы

​

Тыныс алу арқылы микроорганизмдер энергия алады.Тыныс алу — бұл донорлардан акцепторларға электрондардың тыныс алу тізбегі арқылы берілуімен жүретін биологиялық процесс, нәтижесінде АТФ түзіледі. Электрондардың соңғы акцепторының табиғатына байланысты аэробты және анаэробты тыныс алу түрлері ажыратылады.

​

����������-

• Аэробты тыныс алу кезінде электрондардың соңғы акцепторы – молекулалық оттегі (O₂) болып табылады,�ал анаэробты тыныс алу кезінде – байланысқан оттегі түріндегі қосылыстар (мысалы, -NO₃, =SO₄, =SO₃) қолданылады.
• O₂ → Аэробты тыныс алу – сутек доноры: H₂O.
• Нитраттық тотығу (NO₃⁻) – факультативті анаэробтарда жүреді; сутек доноры: N₂.
• Сульфаттық тотығу (SO₄²⁻) – облигатты анаэробтарға тән; сутек доноры: H₂S.

​

​

​

​

O₂-ге қатынасына және оны энергия алу процесінде пайдалануына қарай

���������� �Аэробты тыныс алу – комменсалдар мен патогендердің арасында ең кең таралған процесс.�АТФ молекулалары тотығу фосфорлануы кезінде түзіледі, бұл кезде цитохромоксидазалар, флавинге тәуелді оксидазалар және флавинге тәуелді дегидрогеназалар қатысады. Электрондардың соңғы акцепторы – молекулалық оттек.�Аэробтар еркін оттекті қажет етеді.�Облигатты (қатаң) аэробтар – мысалы, псевдомонадалардың кейбір түрлері.�

• Энергия алу процесінде O₂ пайдаланады, бірақ ол төмен парциалдық қысымда жақсы өседі, себебі олардың құрамында тек O₂-нің төмен мөлшерінде белсенді және күшті тотықтырғыштармен жанасқанда инактивтенетін ферменттер (гидрогеназалар) болады.

������Анаэробты тыныс алу – электрондардың соңғы акцепторлары ретінде «байланысқан оттекті» қосылыстар (нитраттар, нитриттер, сульфаттар, карбонаттар және т.б.) қызмет атқарады.�Облигатты анаэробтар энергия алу үшін оттекті пайдаланбайды; молекулалық оттек олар үшін улы болып табылады – ол микроағзалардың өсуін тежейді немесе оларды өлтіреді.��

Clostridium tetani

��������Факультативті анаэробтар оттек бар ортада да, онсыз да өсе және көбейе алады.�Олар АТФ-ты тотығу және субстраттық фосфорлану арқылы түзеді және тотығудан ашуға (ферментацияға) ауыса алады (мысалы, энтеробактериялар).� �

B. аntracis

Lactobacterium acidophilum

Аэротолерантты факультативті анаэробты бактериялар оттек бар ортада өсе алады, бірақ энергияны ашу (ферментация) процесі арқылы алады – яғни гетероферментативті сүтқышқылды ашу жолымен (мысалы, сүтқышқылды бактериялар).

��

Аэробты тыныс алу энергия тұрғысынан анағұрлым тиімді,

өйткені көбірек мөлшерде АТФ синтезделеді.

�Алмасу ферменттері:

• Оксидоредуктазалар – тотығу-тотықсыздану реакцияларын катализдейді.
• Трансферазалар – атомдар топтарын тасымалдау реакцияларын жүзеге асырады.
• Гидролазалар – әртүрлі қосылыстарды гидролиздік жолмен ыдыратады.
• Лиазалар – субстраттан химиялық топтарды судың қатысуынсыз (гидролизсіз) ажырату реакцияларын катализдейді; бұл кезде қос байланыс түзіледі немесе керісінше, қос байланысқа химиялық топ қосылады.
• Изомеразалар – молекулада элементтер мен топтардың кеңістіктегі орналасуын өзгертеді.
• Лигазалар (немесе синтетазалар) – екі молекуланы қосу реакцияларын катализдейді; бұл процесс АТФ немесе басқа үшфосфат молекуласының пирофосфаттық байланысының үзілуімен қатар жүреді.
• �

​

Аэробты тыныс алу процесі кезінде тотығудың улы өнімдері түзіледі (H₂O₂, –O₂ – еркін оттек радикалдары). Бұлардан жасушаны қорғайтын ферменттер: каталаза, пероксидаза, пероксиддисмутаза.�Анаэробтарда бұл ферменттер болмайды, сондай-ақ тотығу-тотықсыздану потенциалын (rH₂) реттейтін жүйе де жоқ.

Қатаң анаэробтарды өсіру үшін атмосфералық O₂-ні жоюға мүмкіндік беретін жағдайлар жасалады (механикалық, химиялық және биологиялық әдістер арқылы).

• «Газпак» жүйесі – арнайы газ түзуші пакеттермен жабдықталған, олардың әрекет принципі — герметикалық жабылған ыдыстардағы атмосфералық ауаны газ қоспаларымен ығыстыруға негізделген.�

Құралдар: анаэростаттар, анаэробтық бокстар

(ауа шығарылады, содан кейін ыдыс инертті газбен толтырылады),

СО₂ инкубаторлары, шаммен жабылатын эксикаторлар.

Қоректік орталарға оттегіні тотықсыздандыратын заттарды қосу�(натрий тиогликоляты, цистеин, аскорбин қышқылы, сульфидтер, паренхиматозды ағзалар бөліктері, сахароза);

орталарды қайнату;

оттегіні сіңіргіш заттарды қолдану�(сілтілі пирогаллол).

Бактериялардың өсуі – бұл жасушаның құрылымдық және функционалдық компоненттерінің түзілуі және бактерия жасушасының ұлғаюы.

​

​

​

Көбею – бұл өздігінен көбею процесі, нәтижесінде популяциядағы бактерия жасушаларының саны артады.

• Бактериялар көбінесе екіге бөліну (бинарлы бөліну) арқылы көбейеді, сирек жағдайда — бүршіктену арқылы.�Актиномицеттер саңырауқұлақтар сияқты споралар түзу немесе жіп тәрізді жасушалардың фрагментациясы арқылы көбейе алады.

​

Streptomyces spp./ Актиномицеты

• Гр(+) бактериялар — бөліну кезінде жасуша ішіне қарай өсетін бөлгіш перделердің (перегородкалардың) түзілуі арқылы көбейеді.
• Гр(–) бактериялар — гантельтәрізді пішіндердің түзілуі нәтижесінде тарылу (перетяжка) арқылы бөлінеді, содан кейін екі бірдей жасуша түзіледі.

Қоректік ортаны мекендеген бактериялар көбейген сайын, ортадағы қоректік заттар таусылады және олардың өсуі тоқтайды. Мұндай дақыл периодты (үзілісті) культура деп аталады.

Ал егер ортаға үнемі жаңа қоректік заттар беріліп тұрса, бактериялардың өсуі үздіксіз (непрерывный) өсу деп аталады.

• Лаг-фаза – бактерияларды себуден олардың көбеюі басталғанға дейінгі кезең. Оның ұзақтығы шамамен 4–5 сағат.�Бұл уақытта бактериялар өлшемін ұлғайтады, бөлінуге дайындалады, нуклеин қышқылдары, ақуыздар және басқа да жасушалық компоненттердің мөлшері артады.

​

• Логарифмдік өсу фазасы (экспоненциалды фаза) – бактериялардың қарқынды бөліну кезеңі, шамамен 5–6 сағатқа созылады.
• Оңтайлы жағдайда бактериялар әр 20–40 минут сайынтбөлінуі мүмкін.
• (Мысалы: E. coli үшін генерация уақыты – 20 минут, M. tuberculosis үшін – 6 сағат).
• Осы фаза кезінде бактериялар ең сезімтал (осал) күйде болады.

• Стационарлық өсу фазасы – тіршілікке қабілетті жасушалардың саны өзгеріссіз қалып, ең жоғары деңгейге жетеді.
• Бұл фаза бактерия түріне және олардың өсіру (культивация) жағдайларының ерекшеліктеріне байланысты болады.

• Өлу фазасы (лизис, төмендеу фазасы) – қоректік ортаның таусылуына байланысты жасушалардың жойылу кезеңі.
• Бұл фаза бірнеше сағаттан бірнеше аптаға дейін созылуы мүмкін.
• Энтеробактериялар баяу өледі, ал бациллалар тез жойылады.

Бактериялардың өсуін бағалау

• Микроорганизмдерді санау әдістері:
• Горяев камерасында есептеу (n × 2 × 10⁷ формуласы бойынша);
• Фотометриялық әдіс – бұл әдісте лайлылық стандарты қолданылады, яғни бактериялық суспензияның жарықты сіңіру немесе шашырату қабілеті өлшенеді;
• Автоматтандырылған санауыштар – әрбір микроб жасушасының беткей заряды тіркелу арқылы есептеледі.

​

�

Колония санауышы – тығыз қоректік ортада өсірілген тірі жасушалардың

санын анықтауға арналған құрал (КОБ – колония түзу бірліктері).

Бактериялардың мәдени қасиеттері

​

өсу жағдайлары

өсу сипаты

қоректік қажеттіліктері

• Өсу жағдайлары
• рН деңгейі: көпшілік бактериялар үшін – әлсіз сілтілі орта, вибриондар үшін – сілтілі, ал микобактериялар үшін – әлсіз қышқылды орта қолайлы.
• Оттек концентрациясы: аэробтар мен анаэробтарға байланысты.
• Ортаның тығыздығы: сұйық, тығыз немесе жартылай сұйық орта.
• Ортаның осмостық қысымы.

Өсу жағдайлары

​

Культивация температурасы бактериялардың көбею жылдамдығына әсер етеді:

​

Мезофилдер – 20–40°C температура аралығында көбейеді.

Термофилдер – 40–60°C температурада өседі (оларға актиномицеттер, кейбір спора түзуші бациллалар және ішек таяқшасының кейбір түрлері жатады, олар нәжістік ластанудың жаңалығын көрсетеді).

Психрофилдер – 0–20°C температурада өседі (мысалы, ДСЛ қоздырғышы).

​

• Өсу жағдайлары
• Жарықтандыру: фототрофтар үшін жарық қажет. Кейбір шартты-патогенді бактериялар жарық мөлшеріне байланысты пигмент (бояғыш зат) түзеді.

Өсу сипаты:

Өсу уақыты немесе культивация ұзақтығы: көпшілік бактериялар көзге

көрінетін өсуге 18–48 сағатта жетеді; көкжөтел қоздырғышы – 5 тәулікте,

ал Mycobacterium tuberculosis – 3–4 аптада және одан да ұзақ өседі.

Мәдениеттің сыртқы көрінісі:

• Сұйық ортада өсу диффузды лайлану түрінде байқалады,
• түбінде тұнба түзіледі (ірі түйіршікті, ұсақ түйіршікті, үлпілдек немесе шаңтәрізді),
• сондай-ақ беткі қабық түзілуі мүмкін (жұмсақ, дөрекі немесе әжімді).
• Leptospira айқын көрінетін өсу бермейді.

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

Өсу сипаты:

Тығыз ортада колониялар пішіні, өлшемі, беткейі, мөлдірлігі,

тұтқырлығы және түсіне қарай ажыратылады.�Мәдениеттер түссіз, сұрғылт немесе сұр-көк түсті болуы мүмкін

(мысалы, вибриондарда).

Түсі бактериялардың пигмент синтездеу қабілетіне байланысты.�Пигменттер түсі, химиялық құрамы және ерітіндіде ерігіштігі бойынша ажыратылады:�мысалы, ақ, сары, алтын түсті пигменттер стафилококктарда, ал көк-жасыл

пигменттер псевдомонадаларда кездеседі.

Пигменттер жасушаны ультракүлгін сәулелердің әсерінен қорғайды, улы оттек

радикалдарын залалсыздандырады және антибиотикалық қасиетке ие.

​

​

​

​

Өсу сипаты

Микроағзалар мол, қалың өсу, орташа немесе әлсіз өсу бере алады.�Колониялар ірі (диаметрі 4–5 мм), орташа (2–4 мм), ұсақ (1–2 мм) және

ергежейлі (1 мм-ден кіші) болуы мүмкін.

Өсу сипаты

Колониялар ортаның бетінде орналасу пішініне қарай ажыратылады:�дөңес, жазық, куполтәрізді, ойыс, дөңгелек, розетка тәрізді.

Жиегінің пішініне қарай: тегіс, толқынды, тісті (ойықты) болуы мүмкін.

S-түрі – беті тегіс және жылтыр колониялар.�R-түрі – беті күңгірт және бұдырлы колониялар.

Жартылай сұйық ортада укол арқылы себілген кезде:

• Қозғалмалы микроағзалар ортаның лайлануын тудырады,
• Қозғалмайтын микроағзалар тек укол бойымен өседі, ал ортаның қалған

бөлігі мөлдір күйінде қалады.

​

Қоректік қажеттіліктеріне көміртек, азот және өсу факторларының көздері, сондай-ақ бактериялардың белгілі бір қоректік ортада өсу қабілеті кіреді.�Кейбір бактериялар қарапайым қоректік ортада өссе, басқалары қоректік ортаға талғампаз болып келеді.

Таза дақылды бөліп алу

• Таза дақыл – тығыз немесе сұйық қоректік ортада өсірілген бір түрге жататын микроағзалардың жиынтығы.

​

• Таза дақылдар тығыз ортада өсетін жеке (оқшауланған) колониялардан алынады.�

Зерттеудің мақсаты – микроб түрін идентификациялау (анықтау).

Бұл әдіс микроағзаның таксономиялық орнын анықтауға, яғни оны тегіне,

түріне және типіне қарай жіктеуге мүмкіндік береді.

Таза дақылды бөліп алу кезеңдері:

• Инфекциялық материалды жинақтау
• Жеке (оқшауланған) колонияны алу
• Таза дақылды алу
• Түрін идентификациялау (анықтау)

• Идентификация параметрлері:
• Морфологиясы мен боялу (тинкториалдық) қасиеттері
• Микроағзалардың мәдени (өсу) қасиеттері
• Биохимиялық белсенділігі
• Антигендік сипаттамасы
• Фаготиптеу
• Патогенділік факторлары

​

Өсірілмейтін бактерия түрлері

​

Кейбір спора түзбейтін бактериялар көбеюге қолайсыз қоршаған орта жағдайларында (температура, тұз концентрациясы, жарық, O₂ мөлшері, қоректік заттардың жетіспеушілігі) өсірілмейтін күйге өтеді.

Бұл жағдайда бактериялар өлшемін кішірейтеді, сфералық пішінге енеді. Мұндай күйде олар метаболикалық белсенділігін сақтайды, бірақ жасушалық бөлінуді жалғастыра алмайды.

Бактерияларды осындай күйде анықтау ПТР әдісімен немесе арнайы бояу тәсілдерімен мүмкін.

Фото С. Васильевой

Өсірілмейтін бактерия түрлерін (ӨБТ) анықтау әдістері

• Тіршілікке қабілетті жасушаларды тікелей санау әдісі:�Зерттелетін материалға аз мөлшерде қоректік заттар (мысалы, ашытқы экстракты) және налидикс қышқылы (ДНҚ синтезін тежеу үшін) бірнеше сағатқа қосылады.�Нәтижесінде жасушалар қоректік заттарды сіңіріп, өлшемін ұлғайтады, бірақ бөлінбейді.�Сондықтан мұндай үлкейген жасушалар микроскопта айқын көрінеді және оларды санау оңай болады.
• Цитохимиялық әдістер – формазанның түзілуіне негізделген.
• Микроавторадиография әдісі.