Компонентная аллергология

• Аллерги́я (др.-греч. ἄλλος — другой, иной, чужой + ἔργον — воздействие) — типовой иммунопатологический процесс, выраженный сверхчувствительностью иммунной системы организма при повторных воздействиях аллергена на ранее сенсибилизированный этим аллергеном организм

​

• Должно с этим не согласиться

• Эволюционно сформировавшийся защитный механизм элиминации чужеродных белков иммунокомпетентными структурами организма человека

Поэтому с чисто терминологической целью удобно, используя рекомендацию Sela (1973), определять антигенность как серологическую активность антигенов in vitro, а под иммуногенностью подразумевать их способность индуцировать иммунологические реакции in vivo. Естественно, что антигенностью так или иначе будут обладать все антигены, а иммуногенностью – в зависимости от реактивности организма. Антигенность можно измерять и оценивать титрами антигенов в серологических реакциях, иммуногенность – по количественному уровню иммунного ответа

Антигенность – понятие структурное, определяет количество и качество эпитопов белковых стуктур

​

Иммуногенность- понятие функциональное, определяет выраженность иммунного ответа в соответствии с количеством продуцируемых антител к числу эпитопов белковых структур

Аллергология и инфектология - смежные дисциплины

​

Агентом внешнего воздействия в аллергологии является белок

​

Агентом внешнего воздействия в инфектологии является микроорганизм в форме вируса , бактерии, грибов, дрожжей, паразитов

Вопрос

Является ли иммунный ответ на внедрение возбудителя инфекционного заболевания иммунопатологическим процессом (цитата из определения «аллергия»)

Ответ

Нет. Расценивается как защитная реакция иммунной системы, направлена на элиминацию возбудителя

​

Очевидно, что аллергологическая реакция на проникновение во внутреннюю среду белка должна расцениваться таким же защитным механизмом как и иммунный ответ в отношении возбудителя инфекционного заболевания

Белки внешней для человека среды считать априори аллергенами не соответствует нормальной физиологии протеолитических процессов в организме здорового человека

​

(арахис не является аллергеном для всей человеческой популяции, сенсибилизация к компонентам арахиса возникает только у части этой популяции)

Три естественных барьерных препятствий проникновения целостных белковых структур во внутреннюю среду организма человека

слизистая респираторного тракта

слизистая желудочно-кишечного тракта

кожа

​

​

Система протеолитических ферментов у здорового человека расщепляет белки до аминокислот , что исключает возникновение аллергических реакций.

У больных, страдающих респираторными заболеваниями, заболеваниями пищеварительной системы, заболеваниями кожи, белки проникают во внутреннюю среду, сохраняя в той или иной степени элементы целостной структуры, проявляя аллергенные (антигенные) свойства в зависимости от числа и качества сохранившихся после процесса протеолитического расщепления эпитопоп. Это в свою очередь определяет степень иммунологического ответа (иммуногенность), выражаюшейся тяжестью клинических симптомов

​

​

Задача врача клинициста

​

• Определить (проанализировать) характеристики белка, который в той или иной степени сохранности проник во внутреннюю среду после недостаточного воздействия протеолитической системы

​

• Эта задача упрощена тем, что известные, изученные белки - потенциальные сенсибилизаторы, сгруппированы в гомологичные группы с описанными свойствами

Guidance on Allergen Products CPMP/BWP/243/96

руководство

released by the European Medicines Agency

​

Европейская фармакопея 9.0

​

Гомологичные группы

Перекрестная реактивность

​

The principle of homologous groups in regulatory affairs of allergen products--a proposal.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18698143

Экстракты как маркеры в лабораторной диагностике

Каждый экстракт как диагностический маркер состоит из набора компонентов. В силу биологической природы и ассортимент, и количественные характеристики компонентов меняются от партии к партии сырья, из которого делают экстракт. Понятие «точный» экстрактный маркер – не существует. Экстрактные маркеры - «разные»

Результаты связывания сывороточных IgE-антител пациентов, сенсибилизированных к пыльце березы (13 пациентов) и без сенсибилизации (8 пациентов), с белками водно-солевого экстракта березы повислой (t3) и рекомбинантными белками аллергенов березы (линейные аллергоблоты фирмы Mediwiss и DST)

​

​

​

​

​

​

​

​

​

Коэффициент корреляции r (t3 DST/ t3 Mediwiss) = 0,33

Коэффициент корреляции r (r Bet v1/ t3 Mediwiss) = 0,82

Результаты тестирования экстрактов березы от двух производителей сывороткой одного пациента значительно разнятся . Экстракт от Mediwiss на 80% состоит из Bet v 1. С чем это связана? С глубиной обработки сырь, из которого изготовлен экстракт? Можно только догадываться

Результаты связывания сывороточных IgE-антител пациентов, сенсибилизированных к пыльце полыни (17 пациентов) и без сенсибилизации (2 пациента), с белками водно-солевого экстракта полыни обыкновенной (w6) и рекомбинантными белками аллергенов полыни (линейные аллергоблоты фирмы Mediwiss и DST)

​

​

​

​

​

​

​

​

Коэффициент корреляции r ( w6 DST/ w6 Mediwiss) = 0,98

Коэффициент корреляции r ( w6 DST/ rArt v1) = 0,96

Коэффициент корреляции r ( w6 DST/ rArt v3) = 0,28

Коэффициент корреляции r ( w6 Mediwiss / rArt v1) = 0,95

Коэффициент корреляции r ( w6 Mediwiss / rArt v3) = 0,3

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

В случае с экстрактом полыни результаты очень близки, что лишний раз объясняет большую лабильность в “точности” экстрактных маркеров , не зависящей от производителя. Проблема не в производителе, проблема в природе самого экстракта как маркера

Компоненты как маркеры в лабораторной диагностике

Иллюстрация факта возможной заниженной реакции на экстракт в сравнении с реакцией на компонент этого экстракта

Иммунный ответ на целостный экстракт не является арифметической суммой ответов на содержащиеся в этом экстракте компоненты

Сенсибилизации к пыльце березы, амброзии, фундуку, арахису, молоку, моркови не существует

Существует сенсибилизация к компонентам пыльцы березы, амброзии, фундуку, арахису, молоку, моркови

Задача врача клинициста – выявить компоненты аллергенов, к которым у больного сформирована сенсибилизация

Der p 1

Der p 2

Der p 10

Phl p 1

Phl p 4

Phl p 5

Phl p 7

Phl p 12

Используемые (доступные) компоненты ограничены числом

23

7

А что, «недоступные» компоненты не вызывают сенсибилизацию ?

«о чем я не знаю, того не существует»

КОМПОНЕНТЫ (МОЛЕКУЛЫ)

РЕКОМБИНАНТНЫЕ

НАТИВНЫЕ

nPhl p 4 ≠ rPhl p 4

-

rAra h 8 ≠ rAra h 8.0101

На сегодня врач-специалист ограничен в возможности в полной мере оценить компонентную сенсибилизацию

из за

Ограниченного числа компонентов, доступных в аллергологических тестах.

(даже в ассортименте Phadia далеко не все изученные, описанные компоненты, присутствуют в ImmunoCap, ISAC)

из за

большого числа компонентов, которые на сегодня не изучены, не описаны, что не исключает их присутствие в составе целостного аллергена, снижается качество диагностики

​

Такие компоненты могут быть выявлены в постановке ВестернБлот экстракта исследуемого аллергена

Результаты связывания сывороточных IgE-антител семи пациентов, сенсибилизированных к экстракту пыльцы амброзии (1-5,7) и без сенсибилизации к экстракту пыльцы амброзии(6), с белками водно-солевого экстракта пыльцы амброзии полыннолистной (w1) (вестерн блоттинг).

​

ВестернБлот экстракта Амброзии w1. Возможность определить предполагаемую сенсибилизацию ко всем, содержащимся в экстракте, компонентам

На сегодня у врача-клинициста нет системного подхода к оценке результатов компонентной диагностики. Парадигма “мажор = АСИТ” и/или “минор – АСИТ” является только частью структурированной аллергодиагностики

Лабораторная диагностика, использующая исключительно экстракты аллергенов в качестве маркеров, должна рассматриваться как промежуточная, дающая направление, суживающая группы аллергенов, к компонентам которых необходимо выявить сформированную сенсибилизацию

Выявленная сенсибилизация даже к единичным белкам-компонентам дает возможность связать клинические проявления по всей группе гомологичных белков. Например среди растительных аллергенов в следующем ранжире

CCD, Polcflcin, Profilin, PR-10, nsLTP, Storage proteins

Рисунок взят из книги EAACI Molecular Allergology User’s Guide 2016

ГОМОЛОГИЧНОСТЬ ВНУТРИ ГРУПП

Выскокий уровень гомологичности, низкий уровень спецфичности, все профилины – минорные белки

Низкий уровень гомологичности высока степень специфичности , Ara h 2 - мажор

Гомологичность не является равнозначной для всех белковых групп

Предыдущий и последующий слайды наглядно демонстрируют обратную зависимость между гомологичностью и специфичностью белков компонентов, собранных в группах растительных аллергенов.

Высокий уровень гомологичности у Polcalcin, Profilin определяется их очень высокой схожестью в структуре молекул, что ведет к потере индивидуальности или специфичности. Перекрестные реакции для этих белков тотальны. Этих группы состоят их «минорных» белков

У белков групп PR-10, nsLTP специфичность в строении молекул нарастает, что снижает их гомологичность (схожесть) . При этом их схожесть выражена на столько, что делает возможным перекрестные реакции внутри разных ботанических групп ( пыльца, офощи, фрукты, бобы, орехи, латекс). Не редки синдромы, при которых ярковыраженные респираторные проявления имеют причиной сенсибилизацию к компоненту пищевого аллергена и наоборот. В этих группах определяются и «мажорные» и «минорные» белки

​

У белков группы Storage proteins гомология выражена крайне слабо, но при этом они удерживаются в границах единой группы. Специфичность - максимальная. Это исключительно «мажорные» белки

Схема взята из Canonica GW, et al. World Allergy Organ J.2013;6:17.

Зная уровень гомологичности белков-компонентов внутри группы, врач-аллерголог может прогнозировать тяжесть клинических симптомов у конкретного больного.

Так, среди растительных аллергенов высокая гомологичность с низкой специфичностью

(а это характерные признаки «минорных» белков)

для Polcalcin, Profilin выражается в легком течении аллергологического заболевания

Низкая гомология с высоким уровнем специфичности,

(«мажорные» белки)

характерная для Storage Proteins, опасна для пациента тяжелыми, внезапно возникающими проявлениями, вплоть до анафилаксии

ГОМОЛОГИЧНОСТЬ ВНУТРИ ГРУПП

Profilins

Трехмерная структура Phl p 12 (тимофеевка) и Cuc m 2 (дыня).

(одна структура наложена на другую)

Одинаковые аминокислотные остатки окрашены красным, оранжевым – имеющие различия, синим - неродственные

​

Рисунок взят из книги EAACI Molecular Allergology User’s Guide 2016

Выявленная сенсибилизация к даже одному представителю группы Polcalcin, Profilin , освобождает от необходимости детализации исследований внутри этих групп. Заведомо определена положительная реакция на все компоненты этих групп. Тяжесть клинических симптомов минимальна. Рекомендованная терапия – симптоматическая.

ГОМОЛОГИЧНОСТЬ ВНУТРИ ГРУПП

PR-10

Рисунок взят из книги EAACI Molecular Allergology User’s Guide 2016

Выявленная сенсибилизация к компоненту/компонентам групп белков PR-10, nsLTP дает основание самым тщательным образом выявить приобретенную сенсибилизацию к белкам компонентам из других ботанических групп (пыльца, овощи, фрукты, орехи, бобы, латекс). Высока вероятность перекрестных реакций в силу выраженной гомологичности. Задача аллерголога – выявить истинный сенсибилизатор ( дающий максимально выраженную реакцию пациента внутри группы белков PR-10, nsLTP) , что служит определяющим в выборе средства АСИТ.

В качестве средства АСИТ должен выступать рафинированный истинный сенсибилизатор, а не экстракт, пусть даже содержащий этот компонент

Лирическое отступление

Storage = Сторож

​

Белки, хранящие жизненный потенциал, дающие возможность развиться из семени в зрелое растение. Очевидно, орехи, бобовые как наиболее крупные по величине, в размере, содержат наибольшее количество таких белков, потенциально опасны в развитии тяжелых форм аллергии у человека . Можно предположить, генетика таких белков жизнеутверждающая в высшей степени для растения.

Может быть по этому человеческий организм с максимальной «яростью» отторгает, как наиболее чужеродное, такие белки

​

​

Выявленная сенсибилизация к Storage Proteins (2S,11S,7S) , белкам- хранителям запасов развития растения , должно заставить врача-клинициста отнестись к пациенту с максимальным вниманием, поскольку клиника в этом случае, как правило, тяжелая. Этот факт диктует необходимость провести исследования по всем доступным для врача белкам группы Storage Proteins, дабы не пропустить аллерген, незнание о сенсибилизации к которому, может привести к фатальным последствиям . В первую очередь обратить внимание на аллергены из бобов, орехов, зерновых злаков, у которых размер плода определяет количество запасов белков - хранителей

CCD-маркеры:

вид небелковой гомологичности

Phl p 4

Выработка антител к карбогидратным детерминантам (CCD) не проявляется клинически. Но образование этих антител не отменяет возможности выработки антител параллельно к белку-компоненту растительного аллергена, в структуре которого присутствует эта карбогидратно детерминированная небелковая цепь. Положительная реакция на CCD markers должна заставить обработать сыворотку пациента CCD blocker- ом, тем самым связать антитела к CCD. Это в свою очередь снимет ширму, завесу с факта наличия или отсутствия антител к белку, в структуре которого содержится CCD

Гомологичность определяет формат лабораторных тестов.

​

Необходимость брать в исследование максимально доступное количество маркеров ( пример ALEX) отсутствует .

КЛАССИФИКАЦИЯ ПО ПЫЛЬЦЕ ДЕРЕВЬЕВ FAGALES

BETULACEAE

​

Ольха

Береза

Граб

Орешник

Хмель

FAGACEAE

​

​

Каштан

Бук

Дуб

Пример того, как резко сокращается числа пыльцевых маркеров, необходимых в исследовании.

Пыльца березы структурно гомологична пыльце всех деревьев Fagales

Гомологичность дает возможность ограничить число пыльцевых маркеров:

• у деревьев до 4 (береза, олива, платан, кипарис)

​

• У трав до 1 (тимофеевка)

​

• У сорных трав до 5 (амброзия, полынь, постеница, чертополох, подорожник)

ПОКАЛЬЦИНЫ

ПРОФИЛИНЫ

PR-10

nsLTP

Сывороточные альбумины и липокаины

Тропомиозины

Средства диагностики от

На примере пациента Н

1. Экстрактный респираторный
2. Мультиплексный респираторный
3. Мультиплексный пищевой

​

Все блоты инкубированы сывороткой пациента Н.

Линейные блоты, экстрактные, мультиплексные

ВестернБлот экстракта березы t3 , использовавшийся на экстрактном пыльцевом блоте. Инкубирован сывороткой пациента Н. (трек 1) и пациента без сенсибилизации к пыльце березы (трек 2) Шкала молекулярных масс (трек 3)

Bet v 1

Bet v 6

Bet v 1 PR-10, Bet v 1 family member 129 95% 17 кДа�Bet v 2 Profilin 130 22% 15 кДа�Bet v 3    "Polcalcin-like protein (4 EF-hand)"131 10% 24 кДа�Bet v 4 Polcalcin 132 5% 7 кДа�Bet v 6   "Isoflavone reductase-like and  phenylcoumaran benzylic ether reductase"  133 32% 35 кДа�Bet v 7 Cyclophilin 134 21% 18 кДа

Молекулярные массы компонентов экстракта березы t3

14 кДа

​

25 кДа

​

ВестернБлоты экстракта амброзии

30 кДа

​

40 кДа

​

50 кДа

​

компьютерная программа CLIQS

�

Пациент Н. в качестве средства АСИТ использует Oraltek

Description

Native (non-modified) allergenic extracts for specific immunotherapy. Prepared in glycerol for oral (sublingual) administration in spray.

Biological standardisation

Inmunotek standarizes its allergenic extracts in biological units (BU) following the Nordic guidelines. The biological concentration of extracts used in Oraltek is given in Therapeutic Units (TU)/mL. 10,000 TU/mL are equivalent to 10,000 BU/mL.

Oraltek

Что знает врач клиницист об

Biological standardization�Inmunotek standardizes the allergen extracts following the Nordic Countries Norms*, which define that “the activity of an allergen extract has 10,000 Biological Units (BU) when it causes a skin reaction of the same size as that of the positive reference solution consisting of 54.3 mml/L of histamine (histamine dihydrochlorhydrate at 10 mg/mL) when both solutions are administered with the same technique (prick test) in at least 20 subjects who are clinically allergic to the corresponding allergen extract”. Почему 20 , а не 44 или 13, каковы количественные показатели сенсибилизации у добровольцев, К экстракту? Мутно и не убедительно

Immunotek manufactures allergen extracts for producing diagnostics and vaccines under Proper Manufacturing Standards and therefore is authorized by Spain’s Medication Agency.

Oraltek

Биологическая стандартизация – определение количества лекарственного препарата по его эффекту при

экспериментальном сопоставлении с эффектом стандарта.

Биологическую стандартизацию используют в том случае, когда действующее начало препарата невозможно или нерационально выделять в чистом виде и, следовательно, производить его прямое количественное измерение. Такая ситуация возможна при использовании препаратов, получаемых из природного сырья. Содержание активных веществ и биологическая эффективность одного и того же количества сырья в разных партиях колеблется, иногда значительно. Для производства препарата со стандартной дозой активность каждой партии сырья приходится испытывать путем сравнения с общепринятым эталоном, закрепленным в Государственной фармакопее. Количество препарата в этом случае измеряется в установленных законом (Государственной фармакопеей) единицах – единицах действия (ЕД или ED), международных единицах (МЕ) и т.д.

In addition, most commercial allergen extracts used in SIT are well standardized for major allergens, but contain only minimal or variable amounts of minor allergens [90,91]. Thus, patients with sensitization to minor allergens alone will likely not receive sufficient amounts of allergen to achieve a successful outcome by SIT. A recent study reported that patients receiving a 2-year course of SIT with either birch or grass pollen had a much more favourable outcome with SIT when sensitization to the marker allergens of birch or grass pollen were detected compared to patients sensitized to only minor, cross-reactive allergens [92].

​

Биологическая стандартизация по своей природе не может характеризовать отдельные компоненты экстракта, будь они мажорами или минорами

A WAO - ARIA - GA2 LEN consensus document on molecular-based allergy diagnostics

14 кДа

25 кДа

30 кДа

50 кДа

Bet v 1

​

​

«балластные» для пациента Н. белки

Электрофорез экстракта Oraltek

17 кДа слабая реакция

30 кДа слабая реакция

60 кДа реакция не выявлена

1

2

3

WB Oraltek , обработан сывороткой пациента Н.

1. Маркер молекулярной массы
2. WB Oraltek, обработанный сывороткой пациента Н.

3. WB Oraltek, обработанный сывороткой пациента без сенсибилизации к березе t3

Предложения  врачу аллергологу, пользующего пациента Н.

- провести обработку сыворотки пациента CCD blocker-ом и провести дополнительное исследование с линейным пыльцевым мультиплексом.

- проанализировать возможную связь сывороточных белков BSA ,e 1, e 82.

- провести дополнительное исследование на реакцию сыворотки пациента по группе белков PR 10.(например линейный блот Симеста PR 10). На сейчас основным сенсибилизатором выступает Ber v 1, но белки этой группы пищевых аллергенов не изучены ( кроме Gly m 4)

- определиться с необходимостью провести аналогичное приведенному исследованию по березе с вестерном экстракта полыни и амброзии

- определиться с АСИТ. Продолжить ли использование Оралтек , учитывая присутствие в препарате Оралтек конкретной партии, который принимает пациент длительно, "балластных" белков с молекулярной массой 60-120 кДа , сохранят ли свою гипоаллергенность эти белки  для этого пациента и дальше или вызовут со временем дополнительную сенсибилизацию, влекущую осложнение состояния пациента?

- определиться с целесообразностью замены экстрактной вакцины Оралтек на  моновакцину , например Stallergenes SA. The Bet v 1.0101 g for sublingval или Alltrgopharma GmbH rBet v 1-FV for SCIT application. �https://www.researchgate.net/publication/49682549_Recombinant_Bet_v_1_vaccine_for_treatment_of_allergy_to_birch_pollen

Программный (компьютерный) учет и оценка результата при сканировании блота

В качестве примера показан учет ANA Blot (системные аутоиммунные заболевания)

И еще одно предложение

​

Здоровья нам всем