Лекція 14�КУЛЬТИВУВАННЯ КЛІТИН І ТКАНИН РОСЛИН

Клітинна інженерія рослин

• Є важливою складовою сучасної біотехнології
• Базується на використанні клітин, тканин і протопластів рослин
• Тотипотентність – з клітини можна регенерувати цілу рослину

Культура ізольованих тканин

• 1. Здатність ізольованих рослинних клітин продукувати цінні вторинні метаболіти
• 2. Розмноження і використання посадкового матеріалу
• 3. Селекція рослин (отримання гібридів і трансгенних рослин

Основні напрямки використання культури рослинних клітин:

якісно нові продукти,

нові ліки

 промислові технології

вирішення екологічних проблем

наукові дослідження

Метод культивування рослинних клітин і тканин.

1етап – 1892-1902 – перші спроби

2 етап – 1902-1922 – розробка поживних середовищ для культивування тканин рослин

3 етап – 1922-1932 – доведено можливість культивування меристемних тканин

4 етап – 1932-1940 – розроблено основу періодичного культивування тканин рослин

5 етап – 1940-1960 - відкриття фітогормону цитокініну – стимулятора поділу клітин

6 етап – 1960-1975 – злиття протопластів

​

7 етап – 1975 - дотепер

- методи злиття протопластів

- методи селекції

- методи отримання гаплоїдних культур

- створення векторів на основі Ті-плазміди Agrobacterium tumefaciens

i Agrobacterium rhizogenes

- методи перенесення генів у клітини дводольних рослин

Методичні основи культивування органів, тканин, клітин та протопластів рослин in vitro

Приміщення:

1. для миття та стерилізації посуду та інструментів,

2. для приготування та стерилізації поживних середовищ,

3. для цитологічних досліджень,

4. для отримання, пасування та інших маніпуляцій з клітинними культурами,

5. для культивування клітин рослин,

6. боксова або ґрунтова теплиця зі штучним освітленням.

Техніка культивування рослинних клітин

1.Стерилізація рослинних об'єктів

Перед стерилізацією експлант миють мильним розчином, промивають дистильованою водою та обробляють 70 % етиловим спиртом.

Стерилізація 5-20 хвилин (пероксид водню, сулема, гіпохлорити)

Промивання дистильованою водою

2.Поживні середовища

1.Мінеральні солі

2. Сахароза та глюкоза (ізольовані клітини не здатні до автотрофного харчування)

3. Вітаміни групи В

4. Стимулятори росту типу ауксинів та цитокіни (напр., кінетин)

Поживні середовища

Поживні середовища

Поживні середовища

Фітогормони и регулятори роста

Ауксини – спричиняють диференціювання клітин експланта:

β-індоліл-3-оцтова кислота (ІОК);

фенілоцтова кислота (ФУК);

2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота (2,4 Д),

індоліл-3-масляна кислота (ІМК),

α-нафтил-1-оцтова кислота (НУК),

фенілоцтова кислота (ФУК),

2,4,5 трихлорфеноксиоцтова кислота (2,4,5Т),

п-хлорфеноксиоцтова кислота (ПХФК),

піклорам (4-аміно3,5,6 трихлорпіколінова кислота)

Фітогормони і регулятори роста

Цитокініни – ідкують клітинний поділ:

- зеатин [6-(4гідрокси-3метилтранс-2-бутаніламінопурин] ,

- 6γγ ізопентиламінопурін (2iР, ІПА),

- кінетин (N6-фурфуріламінопурін),

- 6-бензиламінопурін (6-бензиладенін, 6-БАП).

Гібереліни – прискорюють ріст росин:

- Гіберелова кислота GA 3 (ГК-3).

Ретарданти – спольвільнюють ріст рослин:

- хлорхолінхлорид (ССС),

- алар

3. Умови культивування клітин

1. Вологість

2. Температурний режим

3. Інтенсивність освітленості, тривалість фотоперіоду

4. Аерація

5.Всі роботи проводять у стерильних умовах у робочому просторі ламінар-боксу з дотриманням правил асептики.

В зависимости от способа и условий культивирования

• Культивирование суспензийных культур
• Культивирование каллусных культур

​

Калусна культура

Каллус – тканина, що утворюється у рослин у місцях ушкоджень

Не має анатомічної структури, складається з недиференційованих клітин (диференційовані рослинні клітини не здатні до поділу)

Може бути різної консистенції (щільна, пухка)

Дедиференціювання як умова переходу спеціалізованої клітини до поділу та утворення калусної тканини

Здатністю до калусоутворення володіють клітини спеціалізованих органів (листа, стебла, кореня, сім'ядолів) і тканин (меристемних, покривних, провідних, основних, видільних, механічних) рослини.

​

Початковою умовою в цьому процесі є дедиференціювання: втрата спеціалізації клітин тканини та відновлення їх здатності до поділу.

Для того, щоб тканина стала калусною

Необхідна присутність у середовищі фітогормонів

- ауксинів (вихід клітин із диференційованого стану, дедиференціювання)

- цитокінінів (забезпечують поділ клітин)

Процес утворення калусної тканини

1.Руйнування деяких клітинних органел

2.Поділ клітин, розтягування та диференціювання в калусну тканину

​

Перехід клітини in vitro з диференційованого стану до дедиференціювання та активних клітинних поділів обумовлений зміною активності генів.

Калусна культура картоплі

Джерела калусних культур

Сегменти стебла, черешка листа, листової пластинки, кореня, плода, зав'язі тощо.

Насіння

Пухлини, що утворюються під впливом бактерій та вірусів

Цикл розвитку калусних культур

Поділ

Видовження

Диференціювання

Старіння

Відмірання

Властивості калусних культур

• Містять специфічні білки
• Зменшено або взагалі немає фотосинтезувальних білків
• Генетична гетерогенність
• Фізіологічна асинхронність
• Триваліший клітинний цикл
• Переважає конструктивний метаболізм
• Вікова гетерогенність

​

Індукція морфогенезу

• Під впливом того чи іншого стимулу морфогенезу калусна тканина стає детермінованою, тобто вона визначила шлях, яким буде проходити її розвиток.
• Лише одна з 400-1000 клітин стає на шлях вторинного диференціювання, що призводить до морфогенезу.
• Здатність сприймати індукцію і специфічно реагувати на неї зміною програми розвитку називають компетентністю клітини.

Регенерація рослин з калусних культур

Somatic embryogenesis in peanut

Суспензійні культури

Одержують з калусної тканини, обробленої пектиназами, або з тканин експланта (лист, стебло, корінь)

Містять невелики клітинні агрегати (5-10 клітин)

Умови вирощування – інтенсивне та постійне перемішування при глибинному культивуванні

Для отримання клітинної суспензії калусну тканину поміщають у посудину з рідким живильним середовищем (2 г тканини на 100 мл середовища).

Переважно використовувати пухкі калюси, які легко розпадаються на кластери та невеликі агрегати клітин.

Суспензія перемішується на качалці зі швидкістю 100-120 об/хв.

Як і калусні культури на щільному середовищі, суспензію клітин періодично переносять на свіже поживнне середовище (пасують).

Кожна лінія культури клітин рослин характеризується мінімальним обсягом інокулята, менше якого культура не відновлює зростання (якщо він менше, тим краще лінія).

Фази ростового циклу суспензійні культури

1. Латентна фаза (лаг-фаза)
2. Експонційна фаза
3. Лінійна фаза
4. Фаза сповільненого росту
5. Стаціонарна фаза

Культура протопластів

Протопласт- це частина клітини, що залишається після видалення клітинної стінки (ферментативним або механічним способом)

​

​

Етапи одержання протопластів

1.Ізольовані листки молодих рослин стерилізують (70 % спирт, потім- 2% гіпохлоріт натрію)

2.Промивають стерильною водою

3. Видаляють нижній епідерміс та подрібнюють.

4. Обробляють пектиназами і целюлазами

5. Очищують фільтруванням

6. Відмивають центрифугуванням

7.Культивують на агаризованому середовищі

​

Властивості протопластів

1.Завдяки здатності поглинати макромолекули і органели їх використовують як реципієнти для трансформації.

2.Служать джерелом для виділення неушкоджених структур і органел

3.Завдяки здатності зливатись використовуються для одержання соматичних гібридів

Переваги метода мікроклонального розмноження рослин

1.Коефіцієнт розмноження вищий

2. Ріст не залежить від сезону

3. Використовуються невеликі площі

4. Відбувається оздоровлення рослин від патогенів

5. Можна отримувати рослини, які важко розмножуються вегетативно

​

​

Забезпечення та контроль умов зростання культур

- забезпечення аерації та стерилізації повітря;

- контроль температурного режиму;

- забезпечення газо- та масообміну;

- контроль складу та якості поживного середовища