Introduction

• La microbiologie est la science qui étudie les organismes vivants microscopiques appelés communément microbes, soit:

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• Certains eucaryotes
• Champignons et certaines algues (végétaux).
• Protozoaires (êtres unicellulaires animaux).

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• Tous les procaryotes
• Cyanophycées ou algues bleues (végétaux).
• Bactéries.

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• Les Virus

La microscopie

• La microscopie est un ensemble de techniques permettant d'obtenir une image des structures biologiques.

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• Le principe est dans tous les cas le même : une onde est envoyée sur la préparation ou émise par la préparation.

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• Aujourd'hui la microscopie est divisée en deux grands groupes, différents par la nature de la particule élémentaire impliquée :

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• Le microscope optique
• Le microscope électronique

1. La microscopie optique

• Le premier microscope fut sans doute fabriqué par Hans et Zacharias Janssen, deux fabricants de lentilles néerlandais, en 1590, mais le modèle final fut inventé par Antoine van Leeuwenhœk en 1664, puis fut amélioré par Christian Huygens.

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• La microscopie optique regroupe:
• Le microscope à fond clair
• Le microscope à fond noir
• Le microscope à contraste de phase
• Le Microscope à fluorescence

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1-1. La microscopie à fond clair

• Utilise des les rayons lumineux.

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• Permet le grossissement de 1500-2000 fois.

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• Épaisseur de coupe ( 1-5 µm).

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• Observation vitale et colorée.

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Microscope à fond clair�

1-2. La microscopie en contraste de phase

• Cette technique permet d'observer les cellules sans préparation ni coloration dans leur milieu d'origine.

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• Le principe est basé sur le fait que les structures biologiques sont transparentes (n’absorbe pas la lumière transmise).

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• Nécessite un éclairage très précis dite éclairage de Koehler.

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• A l’observation, on voit une image en noir et blanc où les différentes structures apparaissent bordées de blanc d’un côté et de noir de l’autre.�

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Le microscope à contraste

de phase

1-3. La microscopie à fond noir

• Utilise les rayons lumineux dans un fond noir.

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• Les zones de la préparation qui diffusent la lumière apparaissent lumineuses ( claires ) sur ce fond noir.

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• Utilisé pour les éléments trop transparents.

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• Les éléments observés apparaissent très brillants ( les flagelles, les fibres ).

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• N'est pas utilisé pour l'observation d'objets colorés.

1-4. La Microscopie à fluorescence

• Cette technique est utilisées pour certaines molécules qui émettent de la lumière quand on les éclaire avec une lumière de longueur d'onde supérieure.

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• On éclaire l'échantillon avec une lumière ultraviolette, violette ou bleue.

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• Consiste à utiliser une coloration fluorescente. Deux colorants très utilisés sont : la rhodamine (émet une lumière rouge) et la fluorescéine (lumière verte).

2. La microscopie électronique

• Il existe deux variantes de la microscopie électronique :

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• La microscopie à transmission

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• La microscopie à balayage

2-1. La microscopie électronique à transmission

• Utilise comme rayonnement des électrons.

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• Observation sous ultravide.

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• Permet le grossissement de 75000 – 5000000 fois.

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• Les échantillons sont sous forme de lames extrêmement fines ( 50 nanomètre ).

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• L'image obtenue peut être vue sur un écran.

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• L'échantillon biologique apparaît plus clair que ce qui l'entoure, d'où le nom de coloration négative. L'échantillon apparaît blanc sur un fond sombre.

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�2-2. La Microscopie électronique à balayage �

• Utilise des électrons.

​

• Observation sous ultravide.

​

• Permet le grossissement de 75000 – 5000000 fois.

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• Fournis des images en 3D.

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• Permet l’observation des coupes d’une épaisseur de 300 – 600 A°.

Définition

• La stérilisation est l'opération qui consiste à éliminer les micro-organismes d'un objet, et de manière durable.

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• En microbiologie, le but de la stérilisation est:
• D'une part de maîtriser les micro-organismes introduits dans le milieu d'étude.
• D'autre part d'éviter la contamination du milieu extérieur et des personnes.

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• Le choix d’une méthode de stérilisation est en fonction de:
• La nature de la substance ou l’objet à stériliser.
• Sa pollution présumée.
• L’équipement disponible au laboratoire.

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La stérilisation peut être réalisée par:

1. Des procédés physiques:
• Stérilisation par la chaleur
• Chaleur sèche
• Chaleur humide
• Pasteurisation
• Tyndallisation
• Stérilisation par filtration
• Stérilisation par radiations

2. Des procédés chimiques:

• Antiseptiques
• Désinfectants
• Antibiotiques

I. La chaleur

1. Chaleur sèche

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• Bec Bunsen (chauffage direct):
• Crée un globe virtuel stérile de 10 cm de rayon de la flamme.
• A utiliser pour les objets en verre ( pipettes, baguettes de verre...), pour certains objets en métal (anse , pince).

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• Fours Pasteur, Poupinel ( stérilisateurs à air chaud ):
• C'est un four classique utilisé pour la verrerie, porcelaine et instruments métalliques.
• Les spores et germes sont détruits en chaleur sèche, par un chauffage de : 4 heures à 140 °C ; 2 heures 30 à 160°C ; 30 min à 180°C.

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2. Chaleur humide

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2-1. Autoclavage:

• Cette technique consiste à faire bouillir de l'eau dans une enceinte close pour augmenter la pression et donc dépasser les 100°C d‘ébullition. Ceci est réalisé à 121°C pendant 15 minutes au minimum.
• A utiliser pour les milieux de culture, matériel en caoutchouc, la verrerie…

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2-2. Les bain-marie ou bain- thermo statés ( ébullition ):

• Un chauffage de 30 minutes à 100°C par ébullition ou un maintien dans la vapeur d'eau bouillante suffit à détruire toutes les formes végétatives.
• A utiliser pour la stérilisation des produits liquides délicats : milieux albumineux, lait, gélatine, solutions concentrées de glucides, ...

2-3. Pasteurisation:

• Conservation des produits naturels pendant un temps limité, ne détruit que les formes végétatives mais pas les spores.
• Le liquide est porté rapidement à 90°C pendant 30s, par exemple,puis on le refroidit brusquement à 10°C.
• Conservation des produits alimentaires.

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2-4. Tyndallisation:

• La tyndallisation est une série de chauffages brefs à des températures de 70°C à intervalles réguliers (3 chauffages d'une heure, 24 h entre 2 chauffages), ceci afin de laisser aux formes résistantes la possibilité de germer pour les tuer au chauffage suivant.
• Utilisation très limitée aux substances thermolabiles non filtrables (émulsion de jaune d'oeuf, vaccins), préparation de milieux à base de sérum ou de jaune d'oeuf.

2. Stérilisation par filtration

• La filtration consiste à faire passer le liquide à stériliser à travers une paroi poreuse ou une membrane qui retient les bactéries.
• Il existe plusieurs types de filtration:
• Les bougies de type Chamberland: tubes à fond arrondi dont les parois sont poreuses, en porcelaine. la dimension de ces pores varie de quelques µm au 1/10ème de µm.
• Disques: disques en verre fritté de porosité de 150 à 1 µm.
• Membranes: membranes plastiques minces comportant des millions de pores par cm2 dont la taille, très uniforme, varie de 8 à 0.01 µm.
• Stériliser des liquides altérables par la chaleur: sérums, solutions hydrolysables, solutions glucidiques, vitamines

Différents filtres

3. Stérilisation par radiations

• C'est la lumière U.V qui est la plus souvent utilisée ( lampes germicides ou stérilampes ).

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• Stérilisation des surfaces et de l'air ambiant, dans des locaux ou des hottes, servant aux manipulations en atmosphère stérile.

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• Utilisation en virologie, cultures cellulaires, préparation et conditionnement des produits pharmaceutiques, ensemencements bactériens, préparation de milieux.

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• Les rayons X ou y sont utilisés pour la conservation de certains produits alimentaires.

3-1. Antiseptiques:

• Tuent les cellules vivantes, microorganismes et autres. Leur action est instantannée. ex: teinture d'iode, permanganate de potassium, eau oxygénée ...
• Utilisation locale chez les êtres vivants, au niveau des plaies et des muqueuses.

3-2. Désinfectants:

• Empêche les contaminations humaines et animales.
• Vapeurs ( formol, gaz sulfureux, oxyde d'éthylène )
• Liquides ( phénols, sulfate de cuivre, de fer, eau de Javel )
• Solide ( chaux vive )
• Utiliser pour tous les milieux extérieurs à l'Homme: eau, air, sol ( objets inanimés, désinfection du matériel plastique utilisé en microbiologie )

3-3. Antibiotiques:

• Les antibiotiques bactériostatiques: stoppent la multiplication des bactéries sans les détruire.
• Les antibiotiques bactéricides: qui tuent les bactéries
• Utilisation in vivo.