Microbiología aplicada.

4 Octubre

Tema 1 Introducción.

1ª Etapa: Precientífica  5000 aC- XVII

2ª Etapa: Nacimiento de la microbiología XVII- XIX

3ª Etapa: Edad de oro de la microbiología XIX- Mediados del XX (Pasteur y Koch

4ª Etapa: Uso del genoma, genética microbiana y resto de “-omicas” Mediados XX- actualidad, auge de la patogénesis bacteriana.

Pasteur y Koch estudiaron sobre la etiología de las enfermedades infecciosas, demostró la teoría pero la hipótesis se formulan bastante antes. Lucrecio en el año 96 ac habló de la relación entre germenes y enfermedad.

Koch investigaba a Bacillus anthracis causante del carbunco en humanos, a través de las esporas que entran en contacto con heridas. Koch descubrió que los animales que enfermaban siempre tenían en la sangre ese bacilo, mientras que los sanos no.  A a partir de la sangre del animal enfermo preparó un cultivo puro de esa bacteria.

1- El microorganismo está en enfermos no en sanos

2- Se tiene que poder cultivar

3-El microorganismo inoculado en sanos provoca la enfermedades

4-

Aplicando esos cuatro postulados  se terminaron aislando muchos de los patógenos más famosos.  Pasteur se encargó de los antibióticos  y también mecanismos de atenuación en patógenos.  Los postulados de Koch no siempre se pueden aplicar completamente, muchos microorganismos no crecen en cultivos.  En casos de usar animales modelos, se habla de gen patógeno, genes que aparecen en organismos enfermos, si se inactiva el gen no aparece la enfermedad....

Hasta los noventa sólo se contaba con los postulados de Koch y poco más. Desde los 40, y por la gran eficacia de los antibióticos se pensaba que las enfermedades infecciosas desaparecerían y se abandonó su estudio. Por eso la vírica está mucho más avanzada que la bacteriana. Pero....los antibióticos tenían cada vez menos efectividad, y muchas enfermedades reaparecieron  e incluso aparecieron nuevas enfermedades. Legionelosis, E. coli enterotóxica, Helicobacter pylori, etc.

La resistencia a antibióticos aumentan bastante sobretodo con el mal uso,

Todo esto provoca el resurgir de la microbiología patogénica, en forma de Microbiología celular, en 1996 por Pascal Cossart, es la relación entre el hospedador y las bacterias patogénicas.  Se buscan armas que impidan pasos de de virulencia sin afectar a genes vitales, evitando así una selección positiva de los más resistentes. Atacando a sistemas de secreción, al QS, proteínas de reconocimiento....

Tema 2 Microbiota normal.

-Residentes:  Viven en todas nuestras superficies durante toda nuestra vida, el embrión se mantiene estéril hasta que rompe la membrana fetal, a partir de ese momento en menos de dos semanas será totalmente colonizado por estas bacterias.

-Oportunistas: Microorganismos que normalmente son inocuos, pero pueden volverse patógenos si encuentran y/o llegan a lugares no indicados, también si encuentran el SI muy debilitado, durante los tratamientos prolongados con antibióticos

-Variable: Varian a lo largo de la vida, en boca intestino y la vagina. En la boca cambian con la aparición de los dientes (superficies nuevas y zonas anaerobias) También al cambiar de tomar sólo leche materna a otras comidas Bifido bacterium  va desapareciendo  En la vagina ocurre lo mismo por falta de estrógenos y cambios de Ph.

-Transeúnte: No mantienen una relación estable, superficies externas.

5 Octubre

Cuando dos seres vivos de especies distintas viven uno dentro del otro al mayor se le llama hospedador y el de menor tamaño se le llama simbionte o huesped.   Existe 3 tipos de simbiosis:

-Mutualismo: ambos beneficiados, suele ser un mutualismo esencial, una especie requiere a la otra. Por ejemplo los rumiantes y su flora intestinal. Es estable

-Comensalismo: Hospedador ni beneficio ni prejuicio, el simbionte obtiene beneficio es una relación estable y suele ser lo más común en el caso humano.

-Parasitismo: EL hospedador sale perjudicado y el huesped obtiene beneficio. Es una relación inestable.

Factores que determinan la microbiota normal.

·Características ambientales:

     -Físicas (Presión de O2, Agua, Temperatura...)

     -Características de las superficies vivas: También llamadas defensas naturales contra los microorganismos, o de superficie.

         +Estructurales: Epitelios, actúan de barrera. Dos tipos de barreras, piel y mucosas. Los epitelios al desprenderse continuamente se van desprendiendo impidiendo haciendo que se desprenda. Se piensa que la microbiota puede controlar la frecuencia de exfoliación.

         +Mecánicas: Movimientos peristáticos del intestino, sistemas mucociliares y la corriente de los fluidos, por ejemplo los ojos

         +Bioquímicas: Nuestras superficies secretan sustancias continuamente, sudor, lágrimas,ácido del estómago etc. Por ejemplo las lágrimas son ricas en lisocimas. Muchos ácidos grasos de los producidos en la piel son micromicidas.

·Adaptaciones microbianas a esas características.

 Los microorganismos que viven en nuestras superficies se adaptan a las características que allí se dan, los factores físicos y químicos, la disponibilidad de los nutrientes sobretodo del hierro. Adaptaciones a sobrevivir en superficies en movimiento (gracias a las adhesinas-receptor sobre superficie corporal).

Microorganismos Habituales:

   -Piel:

Staphylococcus epidermidis (olor suave)

Staphylococcus aureus

Difteroides: Suelen vivir cerca de los folículos pilosos

Corynebacterium (olor fuerte)

Propionibacterium  (Propionibacterium acnes)

Hongos (Pityrosporum espalda y pecho)

Demodex folliculorum (arácnidos)  

-Conjuntiva: (lágrimas impiden mucho crecimiento)

Staphylococcus 

Difteroides

-Cavidad nasal: (muco ciliar impide)

Staphylococcus

Difteroides (incluso corinebacterium)

Streptococcus

Lactobacillus

Moraxelas (g-)

Neisseria(g-) (Neiseria meningitiris)

Haemophilus(g-)

-Boca:

Streptococcus (parte externa del diente)

S. mutans (caries)

Lactobacillus

Corynebacterium

Anaerobios:

-Bacteroides

-Fusobacterium

Hongo: Candida llagas

En la garganta: Streptococcus pyogenes

Tracto intestinal:

El estómago es muy pobre en microbiota.

Helicobacter pylori

En el intestino delgado tampoco hay mucha microbiota debido a los movimientos peristálticos.

En el intestino grueso hay muchas, unas 500. Casitodas anaerobias estrictas

Bacteroides

Fusobacterium

Clostrodium

Bifidobacterium

Aerobios facultativos, enterobacterias.

Escherichia coli

Proteus

Enterobacter...

Cocos gram positivos:

Estafilococcus

Enterococcus

Patógenos oportunistas

Clostridium difficile

E. coli enterotoxica

etc

Genito-urinario:

Toda en la parte externa, no en la vejiga.

Vagina:

Lactobacilus,algunos anaerobios y candidas  

Uretra:

Staphylococcus

Enterococcos.

Controversia entre si la microbiota es Buena o mala.

La microbiota no es esencial, se ha hecho el experimento en animales gnotobiótico. No se puede decir si hacen daño o no, pero en su conjunto se dice que la microbiota es beneficiosa, compiten con el crecimiento de distintos patógenos, esto se llama antagonismo microbiano.  

18 Octubre

Tema 3 Naturaleza de las relaciones simbióticas

Patógeno: virus bacteria y hongo microscópico que dañe al hospedador

Parásito: protozoos, nematodos e insectos.  

Infección: colonización del cuerpo por patógenos.  Otras definiciones también incluyen a los organismos no patógenos.

Infección no es enfermedad.  (Existen portadores, infectados que no desarrollan enfermedades).

 La diferencia entre los patógenos y la microbiota normal suele ser que los patógenos invaden los tejidos corporales.  Allí deben superar las defensas inespecíficas y específicas internas.   Allí tiene que establecerse dividirse y provocar daños.  Y al final tiene que ser capaz de salir del hospedador para buscar otro.

Empezamos con los reservorios, que pueden ser:

-Humanos: Los más frágiles, necesitan las condiciones concretas del cuerpo humano, por ejemplo Treponema pallidum (sífilis) Neisseria gonorrhoeae (gonorrea)  Todo infectado presente o no la enfermedad son reserviorios.

-Animales:  No tiene por que ser por contacto con el animal, puede ser por subproductos o por vectores. A Esto se le llama Zoonosis. Yersinia pestis.Bacillus antracis  , Salmonella spp. (tortuguitas) . Debida a protozoos: Toxoplasmosis.  

-Inanimados: Patógenos capaz de multiplicarse en superficies exteriores a los seres vivos. Ej: Vibrio cholerae, en el agua. Micobacterium tuberculosis, clostridium tetanis. En el polvo estos últimos.  Se comportan de forma muy distinta cuando viven fuera de las superficies vivas.  Mucha capacidad de adaptación.

Vías de entrada:

Las mismas que las de la microbiota normal, mucosas, piel...superficies externas e internas.  Algunos pueden entrar de la placenta al feto, rubeola, HIV...

Por la piel pueden entrar las esporas de Clostridium tetanis.  Infecciones de la piel de Staphylococcus aureus. Virus del sida.

Los respiratorios entran por la mucosa de la nariz.  Corinebacterium diffteriae. 

De conjuntiva, la gonorrea (conjuntivistis en el ojo en recién nacidos.

La posibilidad de que un patógeno sea capaz de infectar depende de la cantidad de patógenos que puedan llegar a las vías de acceso.

Con ello hablamos de

- Dosis infectiva media: Número de patógenos necesarios para infectar al 50% de los animales de experimentación.

 -Dosis necesaria para matar al 50% de los animales de experimentación.

A más bajas más virulentos.

Vías de transmisión.

 Dos maneras principales:

  -Por contacto  (patógenos débiles necesitan estar siempre en el hospedador.

 ·Directo: Persona-Persona. (horizontal)/ Madre-hijo (vertical) Puede ser en el momento del parto, perinatal. Antes del parto, prenatal

 ·Indirecto: Se mantiene un poco aunque no mucho fuera del hospedador: Transmisión por aerosoles, tos y estornudos.  También por fomites; objetos que pueden ayudar a transmitir.  El patógeno no puede sobrevivir en ellos pero si transmitirse si es inmediato.

  -Por vehículos.

Más resistentes.

Pueden ir en vehículos

· inanimados: alimentos, aguas, polvo...   Oro-fecal=agua o alimentos contaminados con mierda. La aérea: aire y polvo.

· vivos: Suelen ser artrópodos. Pueden ser vectores mecánicos y vectores biológicos=transmisión parentenal =zoonosis, son fundamentales.

Un patógeno se puede transmitir de muchas formas.

Vías de invasión.

 

Hablamos de invasión de mucosas pues la piel no la pueden atravesar.

Algunos atraviesan las células epiteliales de la mucosa. Otros usan las células M (fagocíticas)  Otros hacen paracitosis (pasan entre dos células). Pueden quedarse en la submucosa o pasar al torrente sanguíneo o linfático.  Y llegar a otros sitios. A estos se les llaman invasivos. Intracelulares-extracelulares. Para invadir la célula  o se manipulan los microtúbulos o los filamentos de actina. O forzada.

Reto: Eludir las defensas.

Inespecíficas: Protección contra la fagocitosis. Por ejemplo capsula extracelular de polisacaridos. Proteinas superficiales, por ej S. pyogenes. Crea proyecciones de proteina M que evitan contaco

Otros se dejan fagocitar y lo usan para extenderse. Contra las proteinas del complemento se usa la resistencia sérica.

Contra el sistema de defensa específico. Para empezar utilizan variación antigénica, proteasas anti-inmunoglobulinas.

Reto: Establecerse y hacer daño.

Creando toxinas.  Generando una respuesta inmune exagerada. En el hospedador. (Hipersensibilidad) Moléculas reactivas del oxígeno.

Reto: Salir del hospedador.

Muchos salen por donde entran, respiratorios, genitales.Los intestinales son boca-ano.

Concepto de virulencia:  Para que tenga existo debe conseguir todo lo anterior. Las moléculas necesarias para la patogénesis son factores de virulencia.  Adhesinas, invasina, impedinas, agresinas, modulinas

19 Octubre

Tipos de infecciones:

Hay muchos  criterios de clasificación, por ejemplo. Por el tipo de patógeno, o por el lugar que dañan.   Nosotros nos vamos a basar en el tipo de interacción molecular entre patógeno-hospedador.

-El primer criterio: Localización (piel, mucosas..)

-Segundo criterio: El patógeno es invasivo o no. (diseminación)

-Tercer criterio: Extracelular o intracelular.

-Cuarto criterio: ¿Daños provocados por toxinas?

Criterio.

·No invasivo:

  -Piel colonizada.

     

     +Toxinas si: Clostridium tetani. Vive en el suelo, también suele vivir en las heces, la enfermedad ocurre cuando la bacteria coloniza zonas anóxicas de la piel. Sintetizan la toxina tetánica, esta toxina es la que invade a través del SNP, pero su diana es el SNC.  Staphylococcus aureus.  Puede producir muchos tipos de infecciones, si penetra se vuelve invasivo.

     

     +Toxinas no: P. acnes.

           

           -Mucosa colonizada.

             

              +Toxinas si=Corinobacterium diphteriae: Produce la difteria, provoca  pseudomembranas en la faringe que pueden ahogar.  Además producen  la toxina diftérica que es muy dañina. Vibriobacterium cholerae:vive en aguas contaminadas por heces. Se fija al epitelio del intestino delgado y sintetiza una toxia que altera  el intercambio iónico del intestino que provoca la diarrea.  Helicobacter pylori: vive en la mucosa gastrica y es el causante de la gastritis y factor de riesgo para el carcinoma d hígado.

             +Toxinas no = Gonorrea (Neisseria gonorrhoeae) inflamación por citoquininas. Pneumonia ( Micoplasma pnemonae) detiene el movimiento de los cilios de la mucosa respiratoria.  Producen peróxido de hidrógeno.

·Invasivo:

  -Toxinas si.

 

   +Extracelulares: Clostridium perfringens. Miembro de la microbiota intestinal, también en el suelo. Germina en zonas bajas en oxígeno, pero a diferencia de tetanis es invasivo y en los músculos genera la gangrena por medio de toxinas. (gangrena)  Streptococcus pneumoniae. Forma parte de la microbiota normal de muchos organismos, origina pneumonia e incluso puede producir meningitis. Streptococcus pyogenes.  Microbiota normal también. Produce faringitis, amigdalitis.  Si se vuelve crónica es muy peligrosa, ya que las proteínas de superficie de esta bacteria son parecidas a las nuestras. Por ello si durante mucho tiempo se las ataca pueden producir fiebres reumáticas. (enfermedad autoinmune)

   +Intracelulares: Shigella, disentería, vía aguas o alimentos contaminados con heces. Entra por las células M y después invade. Legionella pneumófila.  Legionelosis. Vive en el agua y en el interior de amebas. Transmite aerosoles.

     

  -Toxinas no.  

   +Extracelulares: Hemophylus influenzae. Microbiota normal, hay un serotipo que es virulento, y causa meningitis.  Neisseria meningitidis. Meningitis  también

   +Intracelulares (obligados o facultativos) : Micobacterium tuberculosis.   Salmonella tiphy: fiebres tifoideas. Pasan por las células M, pasa al torrente sanguíneo y llega al hígado. De vez en cuando prolifera da fiebre y diarrea, para ir del hígado al intestino. Es recurrente.    Clamidia thracomals:  intracelular obligado, ¿tracoma?

Tema 4 Adhesión de los patógenos a las células. I

Los patógenos se adhieren a  distintas superficies durante su vida.

-Superficie de las células eucarióticas: piel, mucosas y tejidos internos.

-Superficies no celulares: Matriz extracelular, superficies mineralizadas. Y las artificiales.

Los mecanismos por los que se adhieren son muy similares. Tiene dos etapas. La de pre-adhesión y la de adhesión.   La  primera suelen ser fuerzas físicas. Mientras que la adhesión intervienen fuerzas físicas y moleculares.

Las de van der Waals  actúan a mas de 50 nm por dipolos.

Después son las electrostáticas a 10-20 nm.  Las fuerzas iónicas inhiben las repulsiones.

De 0'5 a 2 nm actúan las interacciones hidrofóbicas.  Ya más cerca son las especificas las que funcionan.

Las moléculas que actúan en las interacciones hidrofóbicas son las hidrofobinas.

Los puentes catiónicos funcionan con los iones metálicos.

Entre las moléculas de superficie de la bacteria (adhesina) y las del sustrato (receptores) Esta unión es especifica.  

La matriz extracelular es una mezcla de polímeros cuya función es mantener la cohesión entre las distintas células.  También interviene en la proliferación la diferenciación y la supervivencia.  

Los polímeros que forman la matriz lo secretan las células que se adhieren a ella misma.

Elementos de la matriz:

-Proteínas fibrilares.

+Colágenos

+Laminina

+Elastina

-GAG-proteoglucanos

-Glicoproteinas adhesivas

+Fibronectina

+vitronectina

+fibrinógeno.

 Los colágenos son las proteínas más abundantes  en los animales, un 20% o más.  Son moléculas largas y rígidas formadas por tres cadenas helicoidales.  Cada una de estas unidades tienen una secuencia de aminoácidos muy ricas en prolina.  Y cada tres aa hay una glicina.  Se conocen hasta 25 cadenas de colágeno distintas, lo que permite hacer más de 10k de trímeros distintos. Pero no se conocen tantos.

·Colágenos formadores de fibrillas. Las fibrillas se pueden asociar entre ellas para formar haces de colágeno.

·Los otros colágenos son los asociados a las fibrillas. Unen fibrillas a otros componentes de la matriz.

·Los últimos son los colágenos formadores de redes. (lamina basal)

*Patógenos que interactúan con el colágeno.

Algunos reconocen la triple hélice helicoidal, otros reconocen las fibrillas.

-Staphilococcus aureus.  Cocos gram postitivos (reconoce triple hélice)

-Streptococcus del grupo A.

-E. coli uropatogénica (gram negativa) reconoce el colágeno IV de las láminas basales.

K. pneumoniae  gram negativa. se une al IV y al V

Laminina: matriz extracelular compuesta de láminas muy flexibles en la que se colocan las células de la lámina. Además actuan de barrera selectiva en la migración celular.  (no son permeables a los fibroblastos)

 Son también un trímero de cadenas alfa beta y ganma.  Se organizan en una estructura en forma de cruz.

*Patógenas que se agregan a la laminina.

-Pseudomona aeruginosa

-Helicobacter pilori.

Ambas requieren que las mucosa o la puel estén dañadas.

Elastina:  Proteina muy abundante en los tejidos elasticos. Se sintetiza como una proteina soluble (tropolastina) pero una vez sintetizada forma fibrillas de elastina que dan elasticidad a los tejidos.  

*Patógenos que se unen a elastina.

Staphylococcus aureus.

GAG: dímeros de ácido urónico y un aminoazucar.

Tenemos cuatro tipos:

-Ácido hialurónico

-Condroitin sulfato

-Heparan sulfato

-Queratan sulfato.

Son todas moléculas  muy largas, ocupan mucho volumen. Tienden a generar geles y están cargadas negativamente, excepto el hialurónico.  Fijan  cationes lo que trae agua, dando turgencia a los tejidos.  

EL hialurónico es el único que no se une a proteínas ni tiene grupos sulfato.

Los proteoglucanos aunque tengan glucidos no son glucoproteinas.  Los restos de azúcares son muy largas. En las glicoproteinas llevan cadenas de azucares ramificadas muy cortas.    

Actúan como filtros moleculares.

*Patógenos que reconocen los proteoglucanos. 

B. burgdorferi (confirmar...!)

Treponema dentícola. Reconoce el ácido hialurónico.

Muchos patógenos llevan ya por si mismos las moléculas de adhesión de GAG. Los Streptococcus tienen una cápsula de ácido hialurónico. Por lo que es capaz de unirse a sus receptores.

E. coli algunas estirpes hacen una cápsula de heparán sulfato, lo que les permite reconocer receptores de superficie celular.

Glicoproteinas adhesivas.

Son un tipo de proteinas cuya función es servir de puente de unión entre las células y la matriz extracelular.

La fibronectina  tienen dominios de unión a muchas tipos de moléculas, es muy flexible. Incluso interaccionar con sigo misma, con colágeno a las células.. Tiene una parte de la secuencia que es la RGD, que reconoce el receptor en las células (integrinas)   hay muchas isoformas, unas solubles en el plasma, para cicatrizar, fagocitosis. Y otras que son insolubles y ayudan a la composición de la lámina basal.

*Los patógenos que reconocen la fibronectina:

Staphylococcus y Streptococcus.

Los Streptococcus tienen dos sitios de unión a la fibronectina.  Uno para pegarse y otro para invadir.  Pero la unión requiere tejido dañado  o en prótesis.

La vitronectina, interviene en la cicatrización de los tejidos y en la coagulación.  

*Patógenos que reconocen vitronectina.

Staphylococcus

Streptococcus

Neisseria gonorroheae.

El fibrinógeno es el sustrato de la trombina que provoca la coagulación de la fibrina.

*Patógenos que reconocen el fibrinógeno.

Staphylococcus, se une al fibrinógeno por el factor de agregación. Además también produce un factor de virulencia que es la Stafilocoagulasa, que provoca la producción de trombina para crear un coagulo

Para que los patógenos puedan atravesar las láminas basales y las matrices extracelulares, usan estrategias:

-Uso de enzimas degradativas:

    +Secretores de proteasas. (colagenasas, helastasas...)  Serratia marcescens.  (queratinitis de la cornea)  Porphylomonas gingivalis.  Y el Clostridium perfringens.

    +No secretores: Invasivas-> Streptococcus neumoniae, H. influenzae, N. meningitidis.  Unos invaden las células fagocíticas y se disaminan con ellas.

No invasivas-> Manipulan las cascadas de proteasas del hospedador.  Degradación fisiológica de la matriz extracelular.

26 Octubre

En la degradación fisiológica actúan proteasas de forma regulada (Metaloproteasas y Serinproteasas)

Los mecanismos de regulación de la destrucción de la matriz

-Activación local de proteasas .

      La mayoría de las proteasas se sintetizan como precursores inactivos y permanecen así hasta ser activado (por ejemplo la plasmina-plasminógeno)

-Concentración de proteasas sobre la superficie celular

      Las células que sobre su superficie concentran proteasas lo que les permite destruir matriz celular de forma localizada.

     

-Secreción de inhibición de proteasas

     Los inhibidores limitan el área de destrucción e impiden que avance. Inactivan a las proteasas (TIMP  y Serpina)

.El sistema del plasminógeno es una de las cascadas que intervienen en las protolisis.  Por ejemplo en degradación de fibrinas, colágenos, fibronectinas, etc.

El plasminógeno es una proteina de suero que por efecto de otras proteasas se activa convirtiéndose en plasmina (reversible).

*Formas de manipular el sistema del plasminógeno.

-Inducir secreción de activadores del plasminógeno. (Borrelia burgdosferi (¿?) incita los monocitos a generar uPA. También el Staphylococcus aureus. Pero este sobre células epiteliales.

-Patógenos que por si mismo producen su propio Plasminógeno. La producen la expulsan y además la pegan en su superficie. Staphylococcus (staphyloquinasa SAK) y Streptococcus (streptoquinasa SK)  Ambas activan al plasminógeno.  Además de activarla la hace más eficaz y a algunos no se pueden desactivar   En el caso de Yersinia pestis ( produce PLA proteasa que activa el plasminógeno facilitando la dispersión) y la llegada a los órganos linfáticos.

El experimento para demostrar que PLA es proteasa  se uso PLA wt y PLA mutante.  Con PLA wt  la Dol50  era de 50. Pero cuando se usa PLA- La dosis es de 107, pero cuando es inyectada  la dosis es la misma para ambas.

-Concentración de proteasas sobre su superficie. En concreto patógenos que tienen en su superficie receptores para el plasminógeno.  Son muy eficaces.  Salmonella typhimurium  Es un ejemplo.

Cuando se cultiva a S. typhimurium con plasminógeno y TPA se observa una actividad proteolítica. Hay que tener encuenta que antes se ha lavado y centrífugado así sólo el plasminógeno pegado a S.typhimurium es el que queda. Demostrando que tiene receptores.  El control se crea añadiendo a todo un inhibidor de la plasmina.  Los receptores en el caso de S. typhimurium están en las fimbrias.

Metástasis bacteriana: Capacidad de agunos patógenos para atravesar la matriz extracelular y las membranas basales mediante su hidrólisis por proteasas pegadas en su superficie.

 Las plasmina que se pega a una bacteria no puede ser inhibida.

Tema 5 Adhesión de los patógenos a las células. II

La adhesión a la superficie de la célula va a tener dos funciones distintas.  En el caso de los que no son invasivos su función va a ser evitar las defensas mecánicas.   Pero en el caso de los invasivos la adhesión va a ser una etapa previa a la invasión celular.

Las moléculas de la célula que participan en la adhesión son las CAM (moléculas de adhesión celular)  Su función normal es la adherir a la célula a la matriz celular o a otras células.

Hay cuatro tipos de moléculas de adhesión molecular, las integrinas las cadherinas, las Ig y la selectinas.   Las integrinas suelen ser célula-matriz mientras que las otras son célula-célula.   Las células de muchos tejidos están fuertemente pegadas entre sí, y a la lámina por uniones de anclaje. Forman estas uniones unos complejos multiproteicos formando unas estructuras visibles al ME.  Existen varios tipos:

-Uniones adherentes (célula-célula por cadherinas

-Uniones focales (célula-matriz por integrinas

-Uniones de adhesión lo mismo que arriba.

 Son varias las proteinas que influyen en las uniones de anclaje...proteinas de anclaje, glicoproteinas (integrinas cadherinas) etc.   Las uniones conectan el citoesqueleto de la célula con la matriz o con la célula adyacente según la unión.

Las proteinas de anclaje tienen parte interna (para el citoesqueleto) y parte extracelular para la matriz o la otra célula.

Adhesiones focales.  Mediadas por las integrinas. La unión del dímero de la integrina a la porción extracelular depende de Calcio.  Existen muchos isotipos de cadenas alfa y beta generados por genes distintos.  Por ejemplo beta 1 está en todas las células.   La alfa 5 beta 1 es la que se encarga de unión a fibronectina.  Las beta 2 son de leucocitos, actúan en procesos inflamatorio.  Las beta 3 son de plaquetas.  La parte intracelular de la cadena beta de las integrinas están encargadas de las uniones a la parte interna de la membrana plasmática. (proteinas intracelulares de anclaje)  Estas internas dirigen todo por medio de la transmisión de señales controlado por el citoesqueleto.    Por ejemplo procesos de señalización dependientes de la adhesión como la división migración o supervivencia.  

  Las adhesiones focales o los focos de adhesión no siempre están activados. Por ejemplo para migrar se van activando y desactivando.   Para activarlos actúan moléculas señal (extra o intracelulares).  Siempr se busca traer al complejo nucleado de la actina. Sobre él polimeriza la actina.   El patógeno busca remodelar el filamentos de actina.

Yersinia pseudotuberculosis  y Yersinia enterocolitica.  Tienen en su superficie una molécula llamada invasina que es una adhesina.  Que reconoce las integrinas Beta 1.  La fibronectina tiene más afinidad por la invasina que por la integrina, sin embargo no se parecen sus secuencias de aminoácidos. Es una convergencia evolutiva.  

Al unirse activa a las moléculas señalizadoras que actuan sobre las uniones de anclaje de los focos de adhesión.   Esto comienza una cascada de activaciones que  activan finalmente a Rac1 que activa la polimerización de la actina.  Con ello pretende invadir.

Interacción de los patógenos en el epitelio intestinal.

-Algunos no invaden ni penetran  Se pegan a la superficie o a la mucina y producen toxinas.

-Los que penetran tienen un problema pues las células epiteliales no tienen receptores en su porción apical.  Así que usan a las células M para entrar.  Las células M están asociadas con vasos linfáticos.  Evitan a macrófago se liberan  y ya pueden unirse a la parte basal del epitelio.  Otros entran usando tejidos dañados.  Otros aprovechan cuando macrofagos migran por el tejido epitelial ellos entran entonces.

Las escherichia coli enteropatogénicas inyectan la proteina TIR a la célula del epitelio.  Esta TIR es receptor para ella misma.    Este proceso despolimeriza la actina de las mecrobellosidades  y crea unos pedestales donde vive anclada.  TIR tiene  homologia con B1.  

Patógeos que se unen inespecíficamente con las integrinas.

-Proteina Yad A de Y. Enterocolitica y Y pseudotuberculosis)  Yad-fb-b1

-Neisseria gonorrhoeae Opa-vitroned-alfa cinco.

-Staphilococcus aureus

2 Noviembre

Unión a las cadherinas. Las cadherinas son una lipoproteinas de adhesión celular, que median uniones homotípica-filica (uniones de ambas células iguales) Para actuar como moléculas de adhesión tienen que dimerizar antes de interacionar con otras cadherinas, dependen de calcio, además del dominio extracelular, tienen otro intracelular que interacciona con proteínas celulares de uniones adherentes.   La interacción en posición “trans”  provoca una agregación de cadherinas.  

El anclaje de las cadherinas se realiza con proteinas, algunas las mismas de las integrinas, pero otras son distintas como por ej las cateninas, además del calcio también hay señales que controlan la cantidad de cateninas.

Por ejemplo, Listeria monocitogenesis utiliza las cadherinas  para adherirse, además esta bacteria es capaz de atravesar cualquier tipo de barrera (intestinal, placenta, hematoencefálica...)  La internalina A- reconoce el fragmento intracelular EC1. de la E. cadherina   Esto provoca una agregación de cadherinas que llevará a una reorganización del citoesqueleto de actina que formará un pseudópodo que  tragarán a Listeria.

Moléculas de adhesión de la superfamilia de las Inmunoglobulinas.

Estas moléculas suelen estar en células nerviosas y en células del sistema inmune.  Estas moléculas tienen en su porción extracelular partes homóloas con las inmunoglobulinas. Median uniones tanto homo como heterofílicas.    Las uniones intracelulares dirigen reorganización del citoesqueleto, están asociadas a vías de señalización como las otras moléculas de adhesión.  Cosa que aprovechan los patógenos para invadir.  Neisseria gonorrhoeae usa estos métodos entre otros.  Activan las mismas vías que en la fagocitosis.

Selectinas.  Moléculas de adhesión celular relacionadas con los carbohidratos, lo que se llama uniones de lectina.   Se presentan en células sanguíneas, plaquetas y células endoteliales.  Es una unión débil y temporal, lo que lea permite rodar por el epitelio.  Helicobacter pylori utiliza este método.   Tienen adhesinas que se comportan como selectinas.  Se llaman Bad A que reconocen el carbohidratos presentes en la superficie de la mucosa gástrica. Leb . También tienen un Sab A que se une a un glicolípido llamado Lex.

Estructuras bacterianas que intervienen en la adhesión.

Casi cualquier molécula de superficie de la bacteria puede actuar en este fenómeno. Por ejemplo el flagelo, las fimbrias (función casi única para adhesión en Gram neg), los fibrillas (Adhesión de Gram pos) , la cápsula. La pared  o la capa S. proteinas cristalizadas.

Estructuras únicas:

-Invasomas, aparecen en Salmonella. Son unos apéndices largos y gruesos que aparecen cuando la bacteria entra en contacto con la superficie.  Y desaparecen cuando entran.

-Orgánulos de adhesión. En micoplasma,  unos botones que se forman en el extro de la bacteria muy ricas en proteínas homólogas a la actina y la miosina.

Las distintas estructuras van colocadas según la bacteria. En el caso de las Gram positivas van colocadas directamente en la pared, mientras que en las negativas pueden salir desde la membrana externa, en otros casos van colocados en las fimbrias.   Conocemos distintos tipos de  fimbrias, dependiendo de donde salen y como se polimerizan.

-Fimbrias de tipo P (pap) (1) Características de  E. coli uropatogénica.  Va insertado en membrana externa. La fimbria es una varilla rígida formada por la proteina A, seguida de un tramo flexible formado por la proteína E y en la punta la adhesina proteína G. Después le sumamos proteinas accesorias. (K,H,F,C que actúan como uniones)  Las proteínas guías  que llevan a estas son chaperonas proteina B.

¿Qué efecto tiene sobre la bacteria y sobre la célula del hospedador la adhesión?

Se sabe más de la célula del hospedador.

Bacteria:

-Primer efecto inherente al cambio de medioambiente, al cambiar drásticamente hay que cambiar la expresión génica.  Por ejemplo la creación de sideróforos (ya que en las superficies celulares el hierro es limitante)

-Genes de virulencia inducidos.

-Inducción de sistemas de secreción dependientes de contacto (tipo III y IV)

-Creación de estructuras específicas.

Célula:

-Algunas veces no hay cambio aparente.  Ejemplo Vibrio choleraeae.

-Cambios morfológicos.  EPEC x ejemplo

-Cambios funcionales, inducción de citoquinas, matrisilina, inhibición de la producción de mucina....

Estrategias para inhibir la adhesión de bacterias a la célula eucariota.

Crear anticuerpos contra la adhesina bacteriana.

Tratar con un análogo de receptor. (versión light de la anterior)

Antigenos de la adhesina del receptor.

X Noviembre Además falta día anterior.

-Ambos mecanismos requieren que la bacteria emita una señal a la célula eucariota

-Alteran las vías de señalización

-La energía necesaria para la invasión la aporta la célula hospedadora.

-Maneras persuasivas de invasión

-Invasión activa: Toxoplasma.

Tienen una etapa móvil llamada zooitos, sin flagelo pero se pueden mover por deslizamiento gracias a la actomiosina. Esta actomiosina se encarga de la invasión. Se van moviendo en circulos hasta provocar una invaginación y entrar en la célula hospedadora.

Se usan líneas mutantes resistentes a la citocalaxina Cel HS + plasmidos R+ Citocalaxina y células HR + plasmidos R (mirar)

Toxoplasma construye su propia vesícula lejos del sistema vesicular, si entra por fagocitosis muere.

Si está en su vesícula aunque se le mate, su vesícula no es atacada ni entra en la ruta endocítica.

A veces es mejor inhibir la fagocitosis para evitar que los patógenos invadan.

Se hace inhibiendo la polimerización de la actina.

Yersinia inyecta con un T3SS proteinas Yop [H=Fosfatasa de tirosina es una quinasa SAC para uniones focales, (t= inhibe Rho), (e= Rho, Rac, CDE Mejora la actividad de hidrólisis de GTP)

El caso de E. coli y sus pedestales es otro ejemplo.

Bacterias que saturan a la célula en la que viven , lisis  y expansión otros consiguen moverse dentro de la célula Para ello  deben manipular el citoesqueleto. Del hospedador y salir de la vacuola.

Listeria es muy efectiva invadiendo y moviéndose en la célula, entra rompe la vacuola con listeriolisina o una vezz fuera una estructura muy organizada dek citoesqueleto de la célula que está invadiendo.

El movimiento depende de ActA anclada en membrana.  Se polimeriza actina sobre la bacteria Acta, nuclea  la polimerización de actinas además lo hace en una estrucuta estable en cola y controla la velocidad, sólo está en un extremo de la bacteria

Tema 7 Invasión II

Bacterias intracelulares facultativas / obligadas.

Una vez dentro buscan un nicho donde vivir

Patógenos Intracelulares:

-En el fagolisosoma, lisosomiales (Coxiella burnetii)

-Vacuolas no lisosomales, intravacuolares no lisosomiales.

     *Vacuolas modificadas (fagosoma que no madura (Histoplasma y Mycobacterium)

     *Secuestradas= no entran en la ruta endocítica (pasiva = Legionella y clamidia. Activa= Toxoplasma)

Extravacuolares

-Listeria

-Shigella

-Ricketsia

16 Noviembre

La maduración de fagosoma temprano a fagosoma tardio no es más que ir cambiando determinados marcadores de membrana.   Los marcadores vienen del endosoma temprano, existe la teria del kiss me and run, para explicar el intercambio de mensajeros.

EL fagosoma tiene toda una batería de mecanismos para degradar.  

-Mecanismos oxídativos:

   *NDAPH oxidasa.  Reduce al oxígeno a ión superóxido.  Este ion genera otras moléculas reactivas del óxigeno que iran atacando la membrana bacteriana.

   *Oxido nitrico-sintetasa: genera oxido nítrico que derivará en otras formas reactivas del nitrógeno que dañan proteinas y ácidos nucleicos.

Esto se llama estallido oxidativo.

-Mecanismos no oxidativo:

   *ATPasa vacuolar (baja ph)

   *Secuestro de cationes divalentes.  (retira moléculas básicas para la vida)

   *Peptidos y proteinas formadoras de poros: defensinas y demás moléculas.  

Bacterias que pueden vivir en el fagolisosoma.

Coxiela bruneti. Es una zoonosis genera la fiebre Q  Hay un reconocimiento entre una adhesina de Coxiela y el receptor del macrófago que es una integrina. Entra en el lisosoma y este madura hasta fagolisosoma madura. Coxiela requiere el ambiente ácido para multiplicarse.  Atenúa la explosión oxidativa.

Mecanismos con los que las bacterias inhiben la fagocitosis.

-Evitar la opsonización.

-Evitar la fagocitosis directamente, por ejemplo inyectando toxinas.

-No evitar la fagocitosis, pero matarlo antes de que madure el lisosoma.

-Bacterias que evitan la maduración del lisosoma o directamente viven en el citosol.

Patógenos que viven en vacuolas no ácidas (modificadas)

Histoplasma capsulatum

Mycobacterium.

Histoplasma produce la histoplasmosis, tiene dos formas de vida, una sobre escrementos y con humedad, y otra en forma de “levadura” que es la virulenta.

Viven en el interior de los endosomas tardios. Pero el hongo debe estár continuamente controlando el Ph.  Necesita un Ph a un nivel suficiente ácido como para solubilizar el hierro, pero no tanto cómo para activar todo el sistema de la vacuola.   La cloroquina aumenta el ph y mata al hongo siempre que no se añada otros compuestos de hierro que revierten el efecto. Si el patógeno muere el fagosoma tardio madura, se necesita al patógeno para manejar la vacuola.

Mycterium vive en lisosomas no maduros,  no dejan madurar al fagosoma a tardio.  Si se le añaden bacterias muertas el lisosoma si madura. (la proteina TACO debe estar implicada)

Que viven en vacuolas secuestradas. 

Legionella y clamidia (fagocitosis)  vs toxoplasma (invasión activa)

Legionella neumophila.   Vive en ambientes ricos en hierro, son endosimbiontes de amebas.  Cuando se inhala por aerosoles, los macrófagos de los alveolos lo capturan. AL formarse la vacuola está se deriva a otra vía. Comienza rodeandose de vesículas del Retículo endoplasmico.  Desvía la vía secretora  y vive en vesículas del reticulo endoplasmico.  Nada más entrar en inyecta a la vacuola por medio del SST4 una proteína tipo RalF que es un factor  de cambios de nucleotidos de guanina.  Esto actua sobre una GTPasa del hospedador (ARF1)  En resumen se recurre de una proteina que atrae sobre ella al RE.

Clamidia vive también en una vesícula secuestrada.  Es una bacteria intracelular obligada.  No posee peptidoglucano, tienen una membrana parecida a la de las Gram- pero con unas proteínas llamadas MOMP

  1. psitacis. Enfermedad intestinal en aves, neumonia en humanos

         C. thraechomatis: provoca glaucoma e infecciones en el aparato genito-urinario.   A veces las infecciones por clamidias son asintomáticas.

Las clamidias entrar por fagocitosis dependiente de actina.  Se forma una vesícula que no entra en la ruta endocitica sino que se fusiona con vesículas del Golgi ricas en esfingomielina.  Esto se llama parasitóforo.  Depende de la especie los parasitoforos se fusionan o no.

Toxoplasma es un protozoo, es el parásito más extendido tanto geográficamente como en rango de hospedadores, aunque su hospedador final es el gato.  Posee un citoesqueleto que le rodea excepto en el poro apical y caudal, está polarizado.

-Sistema de secreción formado por tres tipos de vesículas.

-Rhoptrias

-Granulos densos.

Los tres están implicados en la invasión.  Al encontrarse el protozoo con la membrana del hospedador suelta los micronemas. Los productos de estos micronemas son las adhesinas.  Que se expanden hacia un el poro posterior por un sistema de actomiosina.

La siguiente descarga es la de las Rhoptrias, estas descargan protienas necesarias para la creación de la vacuola.   Usa la membrana del hospedador pero todas las proteinas que usará para la vacuola son propias del protozoo.

Finalmente los gránulos densos que serán proteínas utilizadas para crear una red vacuolar  esta red ayuda a intercambiar nutrientes, estas enganchan con RE, mitocondrias, etc.  Además crea unos poros por los cuales pueden entrar nutrientes de pequeño tamaño   (Pirimetamina mata a este protozoo)

Patógenos extravacuolares:

Listeria, shigella rickettsia....  Todos  los que vivan en el citoplasma deben tener sistemas para disolver la vacuola.  

Listeria tiene tres modos.  Listeriolisina (forma poros en la vacuola).  Una fosfatidilinositol lipasa y una fosfolipasa de amplio espectro    (ambas degradan fosfolípidos)   La estereolisina se activa a Ph ácido.

Consecuencias de la invasión.   Liberación de citoquinas por parte de las células del hospedador, de prostanglandinas. Inducción de moléculas de adhesión. Síntesis del factor tisular.    

Citoquinas y prostaglandinas, median inflamación

Faltan dos días.

30 noviembre.

Tema 11 Toxinas.

Endotoxinas:  

-entran por endocitosis: son solubles están en el medio extracelular.

  ·Inhiben sisntesis proteicas

  ·Interfieren transmisión señal

  ·Interfieren con polimerización de la actina

  ·Interfieren con el paso de vesículas de membrana.

-Son inyectadas por la bacteria.

·Seguimos con las toxinas que interfieren con la polimerización de actina.  Modifican las protienas G monoméricas.  (La familia Rho rac y cdc42) Vemos las que modifican directamente a la actina.   Una toxina de C. botulinum llamada C2. Se secreta de forma inactiva. Como todas las toxinas de forma AB, tiene una parte encargada de reconocer la membrana y después se vuelve activa tras perder parte de la estructura.  En el caso de C2, forma un heptámero, y cuando está listo se le añade la segunda parte el dominio C2 que es la parte citotóxica. Atraviesa la membrana y libera C2, el C2 es una ezima con actividad ADP ribosilante,  ribosila los monómeros de la actina, impidiendo que polimerice.  Al evitar que se añadan más, comienzan a  a deshacerse los filamentos por el principio  terminando por disolverse todo el filamento

·Toxinas que intervienen con el tráfico de vesículas de membrana.

Toxina tetánica y toxina botulínicas (clostridium botulinu).  Secreción de neurotransmisores.  En el caso de la tetánica, la bacteria infecta heridas lo suficientemente profundas para que no exista oxígeno, germinan y las formas vegetativas comienzan a liberar la toxina, y es esta la que entra en el torrente sanguíneo, buscando la diana, que está en el SNC, la interneurona inhibitoria de la medula espinal.

Toxinas alimentarias, hay una infección alimentaria, la bacteria suelta la toxina sobre la conserva, y al comerla llega al torrente sanguineo. Y de ahí a su célula diana. Van al SNP, neuronas motoras.

Efecto de la toxina tetánica:  

Inhibe la liberación de glicina, bloqueando a la célula inhibitoria, por lo que no se pueden relajar. Produce una parálisis expasmódica combuslsiva.

Efecto de la toxina botulínica:

Actuan sobre la neurona motora, evitan que se produzca acetil colina, produce relajación del musculo constitutiva.

Para secretar las vesículas hay que acoplar la vesícula a unas proteinas de la membrana de la célula secretora (sinaptobrevina en vesícula y sintasina + snap-25 en la membrana de la motoneurona) Son metaloproteasas dependientes de zinc  Una sola molécula que se autocorta en dos la heavy y la light, una vez dentro la light reconoce y ataca a la diana que es la sinaptobrevina.

·Las toxinas que se secretan lo hacen por el tipo III y IV.

 Toxinas que interfieren con la fosforilación de la célula eucariota. Por ejemplo YopH de Yersinia pestis.  Fosforila en tirosinas, lo cual es raro en bacterias.  Afecta a las adhesiones focales, por moléculas que se fosforilan y son señalizadoras. Al desfosfosralizarse dejan de poder hacer adhesiones y por ende de fagocitar.

Tir también es inyectada, afecta a la intimina, por ejemplo E.coli EPEC, iyencta su receptor especial para su adhesina, al cual el mismo puede unirse  Esta intimina es reconocida por las proteinas de la célula eucariota, que la fosforila en tirosina.  Reclutando a las proteinas G que controlan la actina.

Proteina Cag A  de Helicobacter Pylory.  Le inyecta Cag A a los epatocitos del hígado. Una vez dentro se inserta en la membrana, allí se fosforila y recluta proteinas y promueve la proliferación, es el primer oncogen conocido de origen bacteriano.

Toxinas que actuan sobre proteinas G monoméricas YopE Yersinia p. y ExoS de Pseudomonas aeruginosa.  Inactivan las GTPasas rac, dcd 42 y Rho. Hidrolizan el GTP dejandolas inactivas. Yot rompe T

Las que alteran el metabolismo del inositol, una toxina de salmonella llamada SopB Linera inositol trifosfato, que es un segundo mensajero que controla el transporte de iones através de la membrana.

Toxinas que inducen la apoptosis. YopP/J yersinia , IpaB  de shigella, SipB de salmonella, afectan a macrofagos.

Las toxinas como herramienta para la biología celular.

Determinar si un proceso está mediado por proteinas G triméricas, se aplican toxinas y listo.

Señalización a través de G monomericas, la dependencia del citoesqueleto de actina, exocitosis...y cualquier proceso al que afecten.  También para introducir moléculas en una célula, creando receptor de la toxina+ proteina que queramos. Inmunotoxinas, permeabilizar...

-Usos de las toxinas:

Vacunas

Botox

También en enfermedades de hiperactividad de las neuronas que producen acetilcolina. Por ejemplo la hiperhidrosis.  Estrabismo Todas con botulínica.

Tratamientos contra el cancer

Tratamiento exponencial de cancer de colon. Se inyecta una forma ateniada esporas de Clostridium novyi

Tratan con liposomas de doxorrubicina)

Las esporas germinan en zonas anóxicas y producen liposomasa  que rompen los liposomas y liberan la droga.

Tema 12  Sistemas de secreción tipo I

Proteinas de la membrana plasmática, en el caso de Gram pos, proteinas de la membrana interna en el caso de gram neg, toxinas, proteinas de digestión externa, o proteinas estructurales para pilis o fimbrias.  

Las gram pos tienen menos compartimentación que las neg (citosol, membrana plasmática, espacio peri y membran externa)  

Sistemas generales de secreción, aparecen en gram neg y pos. Sirven para llevar proteinas a la membrana plasmática, o al espacio peri en gram neg. O medio extracelular en el caso de gram pos.

Hay dos sistemas generales de secreción.

GSP y Tat (translocación dependiente de las argininas mellizas)

Las moléculas exportadas por GSP conectan con sistemas de escreción, pues GSP sólo llega al espacio periplasmico.  Por ello los que sacan al exterior se llaman, Sistemas de secreción dependientes de la translocasa Sec (Type II, Type V, sistema de la chaperona guía-fimbrias pap-.)  

Sistemas independientes de la translocasa , son de gram neg. Pero permiten atravesar del citoplasma al exterior directamente.  (type III, I)

Sistema general de secreción Gsp.  

Tienen que ser capaces de distinguir las proteínas que se van a exportar de las que no.   Para ello las proteínas van a llevar una secuencia de aminoácidos característica,  secuencia lider o secuencia señal.  Tiene tres módulos (positivo/hidrofóbico/carboxílo terminal+ zona reconocible por la peptidasa. Mientras se trasloca se procesa (la secuencia que se corta nunca sale al exterior.

El mejor conocido es el de Escherichia coli. Es un complejo polipéptico, proteinas YEG forman un canal en la membrana. Las DF son accesorias, no forman el canal.  Ambas se conocen como translocasa Sec.  Además colaboran dos proteínas más. SecB y SecA.

Tres etapas en el proceso de secreción.

1) Transporte dirigido de las “preproteina”

2) Translocación a través de la membrana plasmática.

3) Liberación del polipétido modificado al espacio periplásmico o exterior.

  1. Se puede hacer de dos formas, la primera es a través de SecB o por SRP. La proteína va naciendo, y SecB reconoce la señal, asi que se asocia mientras la proteína va creciendo. Es una chaperona  que impide el plegamiento. Además dirige a esta proteina hacia SecA. En el caso de SRP, el sistema está formado por tres componentes (ribonucleoproteina, la cual reconoce la secuencia lider. La ribonucleoproteina unida a un ARN ribosómico. Y un receptor en la membrana.  La ribonucleoproteina, reconoce la proteína naciente.  Al pegarse se detiene la traducción. Todo junto se va a por el receptor de la membrana. Al unirse  se desprende el ribonucleoproteína.  Y se lleva la polimerasa al secretor secA. La traducción está acoplada a la translocación.  Suelen ser proteinas integrales de membrana muy hidrófilas que no van a ser exportadas.
  2. AL unirse SecA y SecB el complejo tiene afinidad por las proteinas de membrana de la translocasa.  SecA es una proteina de unión a Atp Al unirse a atp se producen cambios en la conformación que llevan a la proteina a través de la translocasa.   La función de D y F es evitar que el polipéptido vuelva pa'dentro.
  3. La peptidasa Lep corta el polipeptido. La proteina que se linera ya no lleva la secuencia señal. Y en el periplasma adquiere la estructura.

En tat,  está orientado a integrar proteínas en la membrana. También llevan una secuencia señal, pero más larga.  También tiene tres módulos.  (pos-aminoterminal con las argininas mellizas./ hidrófobo / carnoxilo terminal con la parte para cortar)   Se exportan proteínas ya plegadas.  Suelen ser de cadeas respiratoria o fotosintéticas.

Sistemas dependientes de la transloasa Sec.  

Es más complejo, hay que exportar proteínas plegadas, además en el espacio externo no hay energia.  Las chaperonas del espacio periplasmico llevan las proteínas a la membrana externa y así se forman por ejemplo las fimbrias pap.  

Otros sistemas dependientes de Sec es el typeII  y el typeIV. La diferencia entre uno y otro es si intervienen o no proteinas periplasmicas.  El único que no tiene proteínas periplásmica es el tipo IV.

Type II: Depende de la translocasa Sec. El ejemplo que vamos a ver es de E. coli, aunque su función es sacar  proteinas del espacio periplasmico al exterior, la mayor parte de sus componentes están integrando en la membran citoplasmica, ya que requiere energia que sólo hay en el citosol.  En la membrana externa una proteina integral de membrana de la familia de las secretinas se agregan en complejos muy estables que dejan canales muy grandes en la memb externa.  GspS es una lipoproteina que ayuda a GspD (la de antes) a integrarse.  El resto que son un webo, lo que hacen es unir membrana. Las proteinas que están en la membrana interna tienen mucha homología con las de typoIV.    H, I, J son pseudopilinas (locura ver foto del tema 12)  Las F, K, L ,N tb son integrales de membrana con proyección al periplasma. GspE (unión a AtP) es citosólica  y está asociada con GspC.   GspC es la que da la fuerza para cambiar todo, para llegarle energía a través de E. El colera es asi.

Type IV: No intervienen proteinas.  Atraviesan la membrana por si solas, autotransportadores.  Tienen un extremo aminoterminal pos, secuencia señal translocasa VI, luego dominio central, o dominio pasajero es el que se va a exportar,  y el dominio carboxilo terminal con una estructura hoja plegada beta, este se inserta en la membrana forma un canal y permite que el resto se salga  y en la membrana externa se vuelven a cortar con una peptidasa, dos modificaciones.  A veces la hoja B va en otro polipeptido. Requiere energía sólo para ir al periplasma.  

Tema 13  Sistemas de secreción tipo II

Proteinas que atraviesan membrana externa e interna en un solo paso.  O se sueltan al exterior typo I o se inyectan a una célula de un hospedador typo III y V

Las typo I  por ejemplo en E. coli uropatogénica, Primera proteina es  sistemas de transporte ABC. Después esta engancha co las proteinas MFP que está en el periplasma. Después engachan con las OMP que están en la membran externa formando un canal (trimero)  Lo que se excreta por este sistema no lleva la secuencia lider en el extremo aminoterminal, sino que lo llevan en el carboxiloterminal.   Además esa secuencia no se procesa.  El componente ABC es una atpasa que aplica la energia  MFP no está siempre en contacto con OMP, sino que entran en contacto cuando la proteina entra en ABC. (revolver)  

Los sistemas ABC para interar moléculas son común a todas las bacterias. Pero el componente ABC del TSS 1 es sólo de G neg.  

Sistema de secreción type III: Se encargan de transportar proteínas desde el citosol de la bacteria hasta el citosol de la célula eucariota.  El transporte depende del contacto entre la bacteria y la célula eucariota.  Lo que suele expulsarse son factores de virulencia. Proteínas Yop en Yersinia.  El SST III está muy conservado  entre las bacterias, probablemente por transferencia horizontal. Sin embargo las proteínas que se secretan son muy distinta.  Los genes del cañón y la munición van agrupados, ya sean en plasmidos o en islas.  Aunque la munición no se parece entre si (ni entre bacterias, ni en la misma bacteria) si que se parecen a las proteínas que están en la célula eucariota.  (Se parecen por convergencia? O se parecen por captura.

El nivel de complejidad del cañón es muy alto, formado por más de 30 proteínas. Básicamente: En la membrana plasmática están las Jsc, que forman un canal en la membrana plasmática. Luego JscN es una ATPasa (energia).  Luego el Cilindro que atraviesa el periplasma JscJ.  Seguimos con las proteinas JscG que son secretinas que forman el canal en la membrana externa. Canal extracelular, o aguja formado por JscF.

La forma del disparo está en discusión. Se habla de una señal en el extremo 5' del ARN mensajero, y otra secuencia en el extremo terminal reconocible por chaperonas que dirige el ARNm por el sistema translocador.  (homología estructural y de secuencia, entre SST3 y flagelo.

Cuando entran en contacto hay una proteína que se encarga de censar el contacto, YopN Además es tapón. Hasta que no reconoce célula eucariota no se quita. Al entrar en contacto el tapón sale  y en ese momento sale un represor de los genes Yop que se llama LcrQ.  Al salir el represor y el tampón los genes Yop a full produciendo.  DyB son las primeras que se tranlocan para formar el canal en la membrana de la célula del hospedador. Esto se parece mucho al flagelo y su factor sigma y de su bloqueo por el factor anti-sigma  La secreción es polarizada y dependiente de contacto.

Type IV:   También son proteinas involucradas en virulencia. Están relacionados con los sistemas de conjugación bacterianos. Agrobacterium tumefaciens y su transportador de adnT es un ejemplo. Otro es el de la proteina Caf de helicobacter pilori.   Bordella es la única que no inyecta, usa un type IV para su toxina tertúsica al exterior.

En A. tumefaciens:

Vir D2 = corta DNA

VirE2 =unión a ADN de una sola Cadena..

Los sistemas type IV reconocen las proteinas.

(sistemas, typo IV más antiguos que los de reproducciones sexuales)

En el caos de la toxina tertúsica el sistema sec lleva la toxina al periplasma allí se monta Y un sistema typo IV la expulsa al exterior

Tema 14  Interferencia de los patógenos bacterianos con el ciclo celular.

¿Cómo afecta la célula eucariota a la proliferación de la bacteria?

Las pruebas apuntan a que si que tienen efecto sobre la proliferación de la bacteria.  Bacterias como Micobacterium leprae o Treponema pallium no se han podido cultivar de forma pura.   Se pueden “sembrar” sobre modelos animales.  Se sospecha que no crecen por falta de factores de crecimiento. Algunas bacterias requieren factores de crecimiento bacterianos( Micrococcus luteus, pero no hablamos de estos  Hablamos de factores eucarióticos.  

Por ejemplo algunas cepas de E. coli aumentan su proliferación en presencia de interleuquina I. Además estas cepas son virulentas, tienen una relación específica con esa interleuquina.  Si se secuestra la interleuquina se relaja el crecimiento. Por supuesto la bacteria tiene receptores para la interleuquina. Otras cepas de E. coli responden a otras interleuquinas, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF)

Por ejemplo  S. typhimurium y Shigella pueden agregar TNF aunque  no se sabe su efecto.

En el caso de Micobacterium Tuberculosis. Responde al EGF (factor de crecimiento epidérmico)  El receptor de este EGF en M. tuberculosis no se parece en nada al receptor de la célula eucariota. De hecho es la gliceraldehido 3P deshidrogenasa, también hace de receptor de plasmina, fibrina....  Mientras que la IL 1, 3, 6 y el TGF activan la proliferación de esta bacteria cuando está dentro del macrófago.

Todas estas interleuquinas y factores de crecimiento son para estimular al sistema inmune...así que el hecho de que activen a bacterias es una defensa formidable.  

Ejemplo-hipotesis: La bacteria llega, son pocas y hacen que la célula produzca poca citoquina, esta citoquina no es suficiente para provocar una respuesta inmune pero si para generar mas división en las bacterias. Llega un momento que el número de bacterias es grande y la respuesta de la célula eucariota si es suficientemente fuerte...pero en ese momento las bacterias han alcanzado el quorum y producen  una inhibición de las citoquinas.

¿Pueden las bacterias manipular la maquinaria del ciclo celular ?

EL cliclo celular depende de las quinasas dependientes de ciclina. Hay dos tipos de ciclinas, las de G1 y las mitóticoas. En G1: D (CDk4) y E  Al final de G1 se destruyen. La proteina del retinoblastoma es fosforilada por CDK4. Esta protiena decide si se entra o no en S. La proteia de Rb, puede estar de dos formas, activa (desforforilada) en la que secuestra al factor de transcripción E2F. En su forma hiperfosforilada  suelta a E2F.  

La ciclina E, principalmente hace complejos con CDK2. Una de sus funciones es fosforilar a la proteina del Rb.  

Las ciclinas mitóticas son dos principalmente. A y B.  En el caso A se une entre otras con CDK2,  y activa a PCNA que es una topoisomerasa que abre la doble hélice.  EN el caso de la B hace complejos con la CDK1 (= CDC2) Los complejos son inactivos al principio de G2. Ellos regulan de G2 a M  Cuando se le quita el P añadido por WET se activa. Y pasa al ciclo M

¿Existen bacterias que puedan modificar esto? Si.

Lo hacen mediante ciclomodulinas. O induciendo el cielo o parándolo.

Entre los que inhiben la proliferación:

-E. coli, actinobacillus....  Producen la toxina CDT (toxina de distensión celular)  Esto hace que no se divida y que crezca y reorganice el citoesqueleto.  ¿cómo actúa?

La toxina (CDT)  está formado por dos polipéptidos el primero (A y C) se encarga del reconocimiento y el segundo (B)  es una ADNasa que va a hacer cortes en el ADN. La célula va a intentar reparar el ADN  Lo que en última se destruye CDC25  Esto evita que la célula entre en M y se queda en G2.

Cif ( factor de inhibición del ciclo)  Es un profago integrado, provoca que CDK1 no se desfosforile, induce adhesiones focales.... La división para en G2-M

Fusobacterium tienen FIP (proteina inmuno supresora de fusobacterium)  Inhibe la la proliferación  de linfocitos B y T por antígenos.  No hay síntesis de ADN.  Detenido de G1 a S.

Vac A Helicobacter pylori

Micolactona, por mycobacterium  Pero de ninguno de los dos se sabe como lo hacen .

Toxinas que inducen la proliferación:

Factores necrotizantes citotóxico CNF: Intervienen con la familia de las ATPs monoméricas Rho, activándola.  Al quitarle (desaminar) la actividad atpasica no puede separarse del GTP. Siempre activa.  Además inhibe la citocinesis.... Dando lugar a células multinucleadas.

Este mismo efecto también lo tiene la toxina DNT dermonecrótica de Bordetella.

Una toxina de Pasteurella, se llama proteina PMT, esta toxina es el factor de crecimiento más fuerte que se conoce.  Activa la proliferación de muchos tipos celulares como osteoclastos, osteoblastos, osteocitos... No se conoce muy bien cómo lo hace. Division completa.

Cag A es la toxina de Helicobacter Pylori. Usa un TSS4 para inyectar esta proteina en el epitelio intestinal.  Las enzimas reconocen la toxina como una proteína eucariota.  La forma fosforilada de Cag A es caa de unir la fosfatasa SHP2, al unirse se activa y con ello activa una vía de selañización que lleva a las map kinasas.  También es capaz de pegar y activar una CSK (tirosin quinasa celular=) esta inhibirá a Sac.  Sin fosforilar también pega, pero con ZO1 que es una proteina de las uniones estrechas.  También puede activar la vía Grb2 y activar la vía RAS.

Las Src quinasas

Tema 15  Interferencia de los patógenos bacterianos con la muerte celular.

Muerte: Necrosis y apoptosis.

En la apoptosis distinguimos dos etapas.

Iniciación: Recepción de la señal que va a inducir la apoptosis

La señal puede ser:

·Exógena →  receptor → Segundos mensajeros → Caspasas

Otros casos los receptores están unidos directamente con caspasas.

·Endógena →  Provoca la salida de citocromo C de la mitocondria → activa caspasas

El citocromo C activa una proteina (Apaf) que funciona como andamio para la caspasa iniciadora.

Ejecución: Degradación de todos los sustratos, para cumplir con los fenómenos apoptóticos.

Distinguimos 3 tipos de caspasas.

Caspasas efectoras (3, 6 y 7) , iniciadoras (2, 8, 9 y 10) y la caspasa I

·Las efectoras son proteinas citosólicas monoméricas. Se sintetizan como un solo polipeptido inactivo (pro-caspasa)  La activación requiere de dos cortes. El primer corte que separa en dos lo da otra caspasa, la iniciadora. El segundo corte es autocatalítico, eliminando el prodominio.

·Las iniciadoras, se diferencian de las efectoras por tener prodominios muy grandes, estos prodominios encajan con unas proteinas adaptadoras que encajan con los receptores de muerte. La activación de las caspasas iniciadoras se hace por oligomerización. Ellas mismas se autoprocesan dando lugar a dímeros.

·Caspasa I: Puede activarse tanto por caspasas iniciadoras, como por los bacterias como salmonella o shigella.

Las bacterias siguen dos estrategias. O provocar la apoptosis, o evitarla.

·Inducir apoptosis indirectamente: No lo hacen interfiriendo en la maquinaria celular, por ejemplo las bacterias que producen superantígenos. Otro método indirecto es modificar las concentraciones de AMPcíclico.  (Bordetella, enzima Petúsica, inhibe al inhibidor de la adeninociclása.   Otro método es la creación de poros en la membrana (hemolisinas en condiciones fisiológicas) Otro método es la inhibición de la síntesis de proteinas. (Corinebacterium diphteriae (DT), P. aeruginosa (Toxina A).

·Inducir apoptosis de forma directa: (Listeria, Salmonella, Shigella, legionella, yersinoa, micobacterium, chlamydia, ricketsia, coxiella.... L15

Bcl-2: Antiapoptótica

Bax: pro-apoptótica

Shigella IpaB es y Salmonella SipB. Ambas activan caspasas I   Aparte de guiar a la muerte a los macrófagos y activa la interleuquina I.   Esto causa la muerte de los macrófagos,  lo cual causa inflamación y la atracción de los polimorfos nucleares. Los cuales debilitan la unión de los enterocitos facilitando la entrada de la bacteria.

Listeria causa apoptosis en hepatocitos, linfocitos y células dendríticas. Gracias a listeriolisina.  Esta toxina aparte de liberar a listeria del fagosoma, también daña a la mitocondria, activando la vía interna.

Legionella: apoptosis en macrófagos, lo hace activando a la caspasa efectora III

Yersinia (enterocolíticas y pseudotuberculosis): induce la muerte celular de macrófagos. No son fagocitadas por el macrófago, ellas inyectan YopJ (YopP en el casp de pseudotuberculosa). Que inducen la apoptosis, además antes le inyectan proteinas que paralizan el citoesqueleto.   YopJ inhibe la síntesis de factores de supervivencia.

Mycobacterium tuberculosis.  Puede tanto inhibir como provocar la apoptosis.   Induce la muerte mediante la síntesis de TNF (factor de necrosis tumoral) E inhibiendo a BCL-2 (antiapoptótica) En macrófagos.

También puede inhibir la apoptosis.  Sintetizando un receptor soluble del TNFs, que lo que hace es secuestrar al TNF. Y además activa la via NfkappaB. Que es una vía de la supervivencia.

Chlamydia. Inhibe la apoptosis de células epiteliales y macrófagos. La inhibe impidiendo la activación de la caspasa III  e inhibe la salida de citocromo C.  Durante las últimas etapas induce la apoptosis  induciendo la sobreexpresión de Bax

Rickettsia Inhibe la apoptosis del endotelio vascular.  Esto lo consigue activando a un factor de supervivencia TNFcappaB.

Coxiella. Induce la apoptosis en monocitos  a través de la expresión de TNF  e inhibe en células epiteliales

Tema 16  Virus oncogénicos.

No todos los virus se integran, muchos quedas como episomas, (en infección latente, también están los que lisan (líticos) y los persistentes.   Pero los que  vamos a ver son los que provocan cáncer. Los oncovirus.

Las características de las células transformadas: células que pierden el control de la proliferación

Además es una célula inmortal, pierden la capacidad de entrar en G0, proliferan mucho, pierden la inhibición de crecimiento por contacto, pueden crecer sin anclarse, tienen una morfología distenta, además son tumorigénicas.

En 1911 fue la primera vez que se acepto la existencia de virus que causaban cáncer, por Peyton Rous. El sarcoma de pollo. Un lisado de células tumorales aplicado a un pollo sano le causaba la enfermedad.  Pero en 1908  Ellerman y Bang ya habían hecho eso mismo pero partiendo de una leucemia, pasa que en aquella época la leucemia no se consideraba un cancer.  

Al virus del sarcoma se le llamó vsrc.   Hasta 1970 no se pudo demostrar que la causa era a un oncogen dentro del genoma del virus por (Steve. Martin)  Esto se demostró gracias a mutantes termosensibles.  

El genoma del virus del sarcoma de Rous tenía un oncogen, el cual no era necesario para infectar ni reproducirse.  Otros virus no tenían ese oncogen. Tardan más en provocar tumores, se les llama transformantes débiles. Cuando un transformante débil  provocaba un tumor se sacaban muestras y se iban mejorando las capacidades tumorales del virus hasta ser un transformante fuerte.  Allí empezó la hipótesis del oncogen.  Pensaban que los oncogenes se habían introducido ancestralmente en los virus, pero no era así.  En realidad el cancer se produce por mutaciones de proto-oncogenes, que son homólogos de los formas viricas.

La homologia entre protooncogenes y oncogenes se demostró en el lab de Bishop y Varmus en 1976 por Dominic Sthelin  (gen c-sarc)

¿Cómo capturan genes los retrovirus?  El adn del virus se integra en el Adn  en forma de provirus. Una ves que está integrado puede expresarse para prodicir nuevas partículas víricas.  A veces la transcripción no se detiene u si hay un protooncogen cerca puede quedar atrapado dentro del genoma.  Si un virus sale con el protooncogen,  Podrá extenderse y al integrarse

¿Por qué los genes víricos son cancerígenos? Por ser una versión mutada. Pueden acumular proteina, etc.

Los transformantes déniles deben integraese em o muy cerca en o entre los oncogenes.

No se conocen retrovirus humanos que porten oncogenes.

 El HIV no produce sarcoma quitar, mirar L16, añadir virus hepatitis C (flavivirus) hepatocarcinoma EN humanos principalmente son los virus de ADN

Epstein Barr  (mononucleosis en europa)  linfoma de burkitt y en china canceres nasofaríngeos.

Los paponavirus son los principales que causan cánceres.  

Algunos virus que no causan tumores en una especie pueden causarselos a otra. Los papovavirus: (Poliomavirus= SV40 y el Poliomavirus de ratón)

El SV40 hace ciclo lítico en los monos, pero en humanos provoca tumores al humano)

Adenovirus: líticos en humanos cancerígenos en animales

 

Clasificación de los virus oncogénicos.

-Los que llevan genes cancerígenos

·Oncogenes (homólogos a genes celulares): Sarcoma de Rous, Herpesvirus

·Genes no homólogos de genes celulares: Virus de Epstein Barr

-No llevan genes carcinogénicos.

·Mecanismos que causan inestabilidad genómica.

¿Por qué causan transformación y cancer algunos virus?

-Porque activan cascadas de señalización de forma permamente.

 ·Proteínas víricas con homología  a proteínas celulares: v-Src y v-Ras

 ·Proteínas víricas sin homología pero que actúan como señalizadoras: LMP1

 ·Proteínas no homólogas de proteínas celulares pero que interfieren en la señalización celular: mT (polioma virus de ratón) sT SV40 y E5 (papiloma)

-Porque alteran los puntos de control del ciclo celular.

 

Interfieren con la proteína del retinoblastoma E1A (adenovirus) LT SV40 E7 papiloma o con p53. (LT SV40) E6 papiloma  E1B Adenovirus E4 Adenovirus

Oncogenes de herpesvirus: Son siempre de ADN

 Regulación de c-Src :  Proteina de membrana es una quinasa de tirosina, tiene cuatro dominios, el primero es SH1: actividad tirosín quinasa que está cerca del final.  

Dominio de unión a la membrana es el SH4 (lleva un lípido especial unido para unirse)

SH2 dominio de unión a grupos fosfato  que estén en otras proteinas.  Y el dominio SH3 que reconoce secuencias ricas en prolina.

Esta proteína permite hacer interacciones inter-moleculares.  Ella misma se auto-regula por fosforilaciones.  

En condiciones normales la protiena se encuentra pegada a la membrana, puede estar en dos conformaciones, activa o inactiva. Cuando el SH2 reconoce a un grupo Phosfato del final del extremo carboxilo se une y así está inactiva.  Y SH3 está pegado a las prolinas.  Todo esto provoca una distorsión del receptor quinasa.

Para activarse, se tienen que romper las interacciones intra-moleculares, Aparece una proteina fosforilada por la que tiene más afinidad. Así que se deshace la interacción con SH2. O por que aparece una proteína con más prolinas por la que SH3 tiene más afinidad.  Al ocurrir esto, se autofosforila  y se activa.

En el caso de v-Src llevan una delección en el extremo carboxilo terminal  lo cual la hace  que esté constitutivamente activa.

V-Ras:

Ras-GDP pasa a Ras-GTP.  Se activa por las Map kinasas.... El cambio de glicina a valina en la posición 12  evita que la proteína no pueda hidrolizar el GTP y quede siempre activa.

LMP1: Proteina se inserta en la membrana de la célula y dimeriza sin necesidad de ligando, está constitutivamente activa, la proteina vírica está reconocida por proteinas celulares, en especial al  TNFR.   Se unen a él y activan  a Nf cappa Beta. Que es un factor tumoral.  Activa a una kinasa  Nik ( Map kkk) que añade grupos fosfatos al Nfcappabeta. Lo que libera al factor de supervivencia que va para el núcleo que activa vías de de supervivencia.

.mT:  interfiere con proteínas de señalización, se une a c-Src y a la vez le une una fosfatasa celular (Pp2a) Lo cual desfosforila a SH1, activándola constitutivamente.  Además  atrae a otras  proteínas que actúan en otras vías de señalización, activando cascadas de señalización.

.sT de SV40: Activa el nivel de fosforilación de las mapKK. EL antígeno inhibe a la Pp2a,  haciendo que las map kinasas estén fosforiladas y puedan ir al núcleo para las vías de supervivencia celular.   Además inhibe a una fosfatasa (Creb)  del núcleo permitiendo mayor concentracion en el núcleo.

E5:   En condiciones normales el receptor  Egf reconoce la señal, que activa el proceso, para inactivarlo se endocita el receptor y el ligando a la vía endocítica.  E5 inhibe la destrucción de dificultando la endocitosis, pero  además evita la acidificación del endosoma

La proteina del retinoblastoma domina el paso de G1 a S.   Cuando está hipofosforilada secuestra al factor E2f.  Las proteinas E1A, LT Sv40  y E7 lo que hacen es actvar constitutivamente a la proteina del retinoblastoma.   Si la célula entra en fase S sin tener todo listo puede que p53 limite y lleve a la célula a apoptosis.   Por ello los virus de ADN, deben activar la proliferación e inhibir la apoptosis.

p53 es un factor de transcripción, en las células suele existir poca cantidad, pero cuando se produce daño en el ADN, p53 se estabiliza y o inhibe la proliferación. O induce la apoptosis.  

Induce p21, que para el ciclo y  Bax que lleva a la apoptosis.   LT SV40, E6 papiloma E1B y E4 adenovirus, inhiben apoptosis.   E6 uniquitiniza a p-53 y lo manda al protesoma.  Sv40LT secuestra a p-53 y lo deja inactivo.  E1B de adenovirus, se une a p53 que se vuelve represor de p21 y bax.  E4, secuestra y lo hace no funcional.