ИНСТРУКЦИЯ 

по применению набора микроматриц для выявления

ДНК патогенов картофеля методом ПЦР

с гибридизационно-флуорес­центной детекцией

«Фитопатогены картофеля. Чёрная ножка»

ОГЛАВЛЕНИЕ

НАЗНАЧЕНИЕ        3

ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА        3

Принцип действия        3

Состав набора        3

Комплектация набора        4

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ        4

Аналитическая чувствительность        4

Аналитическая специфичность        4

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ        5

ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ        5

АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ        5

Подготовка проб        6

Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени»        7

РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ        9

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА        9

СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ        10

НАЗНАЧЕНИЕ

Набор микроматриц «Фитопатогены картофеля. Чёрная ножка» предназначен для выявления специфических последовательностей ДНК в геноме Pectobacterium atrosepticum, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis, Pectobacterium wasabie, Dickeya solani и Dickeya dianthicola методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме «реального времени» с использованием микрочипового амплификатора нуклеиновых кислот «АриаДНА».

Материалом для проведения ПЦР служат пробы ДНК, полученные из клубней или зеленой массы картофеля.

Набор предназначен только для применения in vitro.

Набор рассчитан на проведение 25 анализов по 3 пробы в каждом.

ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА

Принцип действия

Выявление специфических для микроорганизмов последовательно­стей ДНК осуществляется методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в ре­жиме «реального времени».

Состав набора

В состав набора «Фитопатогены картофеля. Чёрная ножка» входит 25 микроматриц с иммобилизированными ПЦР-смесями (рис. 1), а также 1 пробирка с буфером и 1 флакон с герметизирующей жидкостью.

Рисунок 1. Внешний вид микроматрицы

Комплектация набора

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Аналитическая чувствительность

Минимальная детектируемая концентрация ДНК составляет 1 нг/мл.

Аналитическая специфичность

При выявлении ДНК Pectobacterium atrosepticum, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis, Pectobacterium wasabie, Dickeya solani и Dickeya dianthicola подтверждено отсутствие неспецифических реакций на образцы ДНК Solanum tuberosum в концентрации 103 нг/мл.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Все компоненты набора реагентов в используемых концентрациях являются неток­сичными.

ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ

1. Микрочиповый амплификатор нуклеиновых кислот в режиме реального времени «АриаДНА» (Люмэкс, Россия).
2. ПЦР-бокс.
3. Центрифуга/вортекс.
4. Дозаторы полуавтоматические одноканальные со сменными наконечниками с изменяемым объёмом отбора жидкостей: от 0,5 до 10 мкл, от 5 до 50 мкл, от 20 до 200 мкл и от 200 до 1000 мкл.
5. Одноразовые наконечники к дозаторам с фильтром.
6. Стерильные пробирки для ПЦР объемом 600 мкл.
7. Штативы для микропробирок объемом 600 мкл.
8. Перчатки медицинские одноразовые.

АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ

        При проведении анализа рекомендуется использование образцов с концентрацией ДНК 20–500 нг/мкл. Выделение ДНК из подготовленного материала проводится в соответствии с инструкцией к используемому набору (например, «ДНК-сорб-B» или «ДНК-сорб-С-М» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора).

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

Подготовка микроматрицы

Перед использованием микроматрицы, необходимо убедиться в его целостности, наличии штрих-кода и отсутствии трещин и сколов в реакционной зоне и на рабочей поверхности микроматрицы.

Запрещено касаться реакционной зоны пальцами.

Аккуратно удалить защитную пленку с микроматрицы. Следить за сохранностью штрих-кода.

Вставить микроматрицу в картридж. Все манипуляции по введению растворов в микрореакторы проводить только в картридже.

Перед проведением анализа реакционную зону микроматрицы покрыть герметизирую­щей жидкостью в объеме 620 мкл. Герметизирующая жидкость должна покрывать всю реакционную зону однородным слоем, недопустимо образование пузырьков на по­верхности жидкости.

После герметизации микроматрицы все дальнейшие манипуляции с картриджем должны обеспечивать его горизонтальное расположение. Необходимо следить, чтобы герметизирующая жидкость не вытекала за пределы реакционной зоны через края подложки.

Подготовка проб

1. Отобрать и промаркировать 4 микропробирки (№№ 1-3 для проб и № 4 для контрольных образцов). 
2. В пробирки №№ 1-2 внести по 1,5 мкл Буфера и по 8,5 мкл ДНК.
3. В пробирку № 4 внести 2,3 мкл Буфера и 12,7 мкл деионизованной воды.
4. Полученные смеси тщательно перемешать, капли со стенок пробирок осадить кратким центрифугированием на центрифуге/вортексе (3 с).
5. В соответствии с топологией микроматрицы (рис. 2) ввести смеси с пробами (№№ 1-3) в микроре­акторы в объеме 1,2 мкл под слой герметизирующей жидкости. Аналогично, в микро­реакторы, предназначенные для контрольных образцов, ввести смесь № 4.

Рис. 2. Схема расположения микрореакторов на матрице для выявления ДНК возбудителей мягкой гнили картофеля.

Pa — Pectobacterium atrosepticum; Pcc — Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum; Pcb — Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis, Pw — Pectobacterium wasabie, Ds — Dickeya solani; Dd — Dickeya dianthicola; IC — внутренний контрольный образец, K+ — положительный контрольный образец, K− — отрицательный контрольный образец.

Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени»

Управление амплификатором АриаДНА, в том числе и проведение анализа образ­цов, осуществляется при помощи программного обеспечения Ariadna. Полная инфор­мация о проведении анализа представлена в Руководстве пользователя к программ­ному обеспечению микрочипового амплификатора нуклеиновых кислот в режиме ре­ального времени «АриаДНА».

Поместить картридж с микроматрицей в термоблок амплификатора. Во время прове­дения анализа термоблок должен быть плотно закрыт.

В основном окне программы выбрать меню «Анализ» (для создания нового проекта необходимо выбрать меню «Проект»). Во вкладке «Терморежим» меню «Анализ» ус­тановить программу амплификации:

* - на этом этапе производится регистрация сигнала

Назначить детекцию флуоресцентного сигнала в конце цикла амплификации.

Во вкладке «Детектор» по двум каналам для флуорофоров FAM и ROX установить следующие параметры:

Во вкладке «Шаблоны» определить микрореакторы матрицы по Образцу и Каналам в соответствии с топологией микроматрицы (рис. 2). Флуоресцентный сигнал, соответствующий наличию ДНК P. wasabie, P. carotovorum subsp. carotovorum и D. solani детектируется по каналу 1 (FAM), ДНК P. atrosepticum, Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis, D. dianthicola и ВКО (IC) — по каналу 2 (ROX).

Запустить программу амплификации.

После проведения анализа необходимо утилизировать использованную матрицу. Для этого необходимо извлечь картридж с микроматрицей из амплификатора.

Извлечь матрицу из картриджа и поместить в утилизационную емкость, заполненную дезинфицирующим средством.

После утилизации отработанной микроматрицы необходимо провести очистку картриджа безворсовой салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором.

РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Регистрация результатов амплификации происходит в режиме «реального времени». Изменение уровня флуоресценции по каналам FAM и ROX отображается в закладке «Графики».

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА

Анализ результатов проводится с помощью программного обеспечения микрочипового амплификатора нуклеиновых кислот в режиме реального времени «АриаДНА».

В меню «Настройки графиков» отметить флажком опцию «Сглаживание» и установить следующие настройки расчетов:

При необходимости отметить флажком опцию «Удалять флуктуации LED».

Расчет пороговых циклов (Ct) производится программным обеспечением амплификатора автоматически.

Результат анализа считается достоверным, если выполнены следующие условия:

1. Для положительного контроля ПЦР (К+) по каналам FAM и ROX значения порогового цикла (Ct) не превышают 35.
2. Для отрицательного контроля ПЦР (К+) по каналам FAM и ROX флуоресцентный сигнал не регистрируется.
3. Для внутреннего контрольного образца регистрируется флуоресцентный сигнал и значение порогового цикла (Ct) не превышает 35.

В противном случае результаты анализа считаются недействительными, и рекомендуется повторная постановка.

ДНК патогенов картофеля ОБНАРУЖЕНА, если для соответствующего микрореактора значения порогового цикла (Ct) не превышают 35.

ДНК патогенов картофеля НЕ ОБНАРУЖЕНА, если для соответствующего микрореактора флуоресцентный сигнал не регистрируется или значение порогового цикла (Ct) превышает 35.

СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ

Срок годности: 6 месяцев. Микроматрицы с истекшим сроком годности применению не подлежат.

Транспортирование: при температуре от 18 до 23 °С не более 10 суток.

Хранение: при температуре от 18 до 23 °С в защищенном от света месте.

Рекламации на качество набора микроматриц «Фитопатогены картофеля. Чёрная ножка» направлять на предприятие-изготовитель ООО «ГенБит» по адресу: 117105, г. Москва, Варшавское шоссе, д. 28А, эт. 5, пом. XIII A, комн. 15. Тел.: +7 (495) 981-54-49. Факс: +7 (495) 981-54-49.