УДК 591.413:591.861].044: 546.221.1:599.323.4

Д.С. Зеленский, В.М. Бондарь*, О. И.Жуковский*, В.И. Поляков*, А.И. Соловьёв

_______________________________________

Д.С. Зеленский

В.М. Бондарь – руководитель фонда*

О.И. Жуковский – президент фонда*

В.И. Поляков – председатель наблюдательного совета фонда*

А.И. Соловьёв – проф., д.м.н., зав. отд. «Экспериментальной терапии» (tonysolpharm@gmail.com)

 

ВЛИЯНИЕ ДИИЗОПРОПИЛФОСФАТ-ОЛИГОЭТИЛЕНГЛИКОЛЬ ТАУРОХОЛИЕВОЙ КИСЛОТЫ НА Ca2+-ТРАНЗИЕНТЫ В ГЛАДКИХ МЫШЦАХ АОРТЫ ЗДОРОВЫХ КРЫС

ГУ «Институт фармакологии и токсикологии НАМНУ», 03057 Киев

*Международный благотворительный фонд «Киевская Русь», 01014 Киев

Ключевые слова: Таурохолиевая кислота, диизопропилфосфат-олигоэтиленгликоль таурохолиевая кислота, Орион, Са2+, гладкие мышцы сосудов, Fura-2AM, эндотелий.

1.          Вступительная часть

Цель данной работы заключалась в исследовании механизмов действия диизопропилфосфат-олигоэтиленгликоля таурохолиевой кислоты (ТК), которая является основным действующим компонентом лабораторного образца препарата «ОРИОН». Результаты проведенных ранее исследований свидетельствуют о том, что ТК  обладает отчетливо выраженными геропротекторными свойствами [1], однако данные о влиянии препарата на функциональное состояние эффекторных элементов сердечнососудистой системы отсутствуют. Это является серьёзным пробелом в доклиническом изучении препарата, т.к. именно хронические заболевания сердечнососудистой системы являются основным фактором уменьшения продолжительности жизни.

Новый всплеск интереса к  жирным кислотам (ЖК) начался благодаря исследованиям последних лет, которые показали существование специфических ядерных рецепторов BAR (bile acid receptor), известных под названиями FXR или NR1H4 [13]. Появились данные, что активация этих рецепторов в гладкомышечных клетках (ГМК) может индуцировать апоптоз путём экспрессии целевых генов FXR - SHP (small heterodimeric partner) и PLTP (phospholipids transfer protein) [11].

В исследованиях 2008 года было также показано [9], что FXR принимает непосредственное участие в регуляции тонуса сосудов посредством активации промотора эндотелиальной NO-синтазы. Последняя и приводит к усилению синтеза NO в эндотелиальных клетках  и расслаблению сосудов.

Одновременно с  ядерными рецепторами, идентифицированы рецепторы плазматической мембраны – серпентины (рецепторы, сопряженные с G-белком), обладающие специфическим сродством  к ЖК [6] (TGR5/Gbar1). Действие ЖК на клетки, которые экспрессируют данные рецепторы, приводит к усиленному синтезу цАМФ, активации МАР-киназного сигнального пути, и впоследствии, интернализации рецептора  [14].

Последние исследования [7] убедительно демонстрируют важную роль ЖК во внутриклеточной регуляции обмена жиров, углеводов, вовлечение рецепторов связанных с G-белками в процесс развития метаболического синдрома и сахарного диабета. Вместе с тем, отсутствуют фундаментальные данные о влиянии ТК на тонус сосудов и Ca2+-транзиенты в ГМК.

Цель работы заключалась в изучении внутриклеточных механизмов действия Ориона на кровеносные сосуды. Известно, что сократительная активность ГМК регулируется внутриклеточным кальцием. Поэтому, были исследованы изменения связей между индуцированными изменениями тонуса сосудов и концентрации внутриклеточного кальция  ([Са2+]і) под действием ТК на изолированных препаратах аорты крыс. Выяснение механизмов действия ТК и взаимосвязь между индуцированными изменениями тонуса ГМК и концентрацией  [Са2+]і является чрезвычайно важным для понимания механизмов специфичного действия ТК и разработки на её основе новых лекарственных средств и методов лечения.

2.          Материалы и методы

Методика одновременной регистрации силы сокращения и внутриклеточной концентрации ионизированного кальция

В экспериментах были использованы сегменты аорты грудного отдела самцов крыс линии Вистар-Киото массой (210±30) г. Все процедуры с крысами проводились согласно рекомендациям Европейской конвенции защиты животных, которые используются в экспериментальных и других исследованиях. Сосуды тщательно очищались от соединительной ткани и разрезались на кольца шириной 2 мм. Все процедуры с сосудами проводились при комнатной температуре в растворе Кребса, состав (ммоль/л): NaCl 122, KCl 4,7, NaHCO3 15,5, KH2PO4 1,2, CaCl2 2,5, MgCl2 1,2 и  глюкоза 11,5, pH 7,3-7,4. Эксперименты проводились с интактными и деэндотелизированными кольцами, которые выворачивались эндотелием наружу. При необходимости, эндотелий удалялся механическим путём, с помощью фильтровальной бумаги. Одновременно фиксировались изменения [Ca2+]i  и сократительные реакции, возникающие в ГМ, предварительно сокращенных деполяризирующим гиперкалиевым раствором (60ммоль/л) или активацией альфа-адренорецепторов в ГМ фенилэфрином (10-6моль/л).

Экспериментальный препарат сосуда находился в камере 300 мкл, вмонтированной на предметный стол флуоресцентного микроскопа ЛЮМАМ-И2 (С.-Петербург, Россия). Изменения [Са2+]і измерялись с использованием флуоресцентного кальциевого красителя Fura-2 [20]. Загрузка красителем препаратов проходила при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение четырех часов. Сегменты сосудов помещались в загрузочный раствор со следующим составом: Fura-2AM 10 мкмоль/л; DMSO 2,5% (по объёму); Pluronic F-127 0,5% (по массе); раствор Кребса 95% (по объёму) рН - 7,35. После загрузки все образцы сегментов сосудов переносили в ванночку с раствором Кребса, где они оставались более 30 минут. Экспериментальный препарат сосуда фиксировали на крючках датчика сокращений в рабочей камере при температуре раствора 36°С, с тоническим напряжением 10-15 мН. Во время эксперимента все растворы подавались в камеру со скоростью 1 мл/мин. (перистальтический насос Masterflex). Результаты измерений [Ca2+]i представлены как отношение (R = I340nm /I380nm) интенсивности флуоресценции сигналов I при 340 и  380 нм, учитывая значение фоновой флуоресценции согласно методике [4, 2]. Для этого в конце эксперимента для гашения флуоресценции красителя использовался раствор Кребса Mn2+ (20ммоль/л).

 

Реактивы

Все неорганические соединения получали в Sigma Chemical Co. (St. Louis, штат Миссури, США), Fura-2 AM - в Molecular Probes, Inc. (Eugene, штат Орегон, США).

Статистика

Все приведенные данные поданы в виде среднего арифметического  ± погрешность среднеарифметического. Сравнение полученных величин проводилось согласно методике Стьюдента для непарных измерений. Расхождение считалось достоверным, если величина р была меньше 0,05. Все статистические расчеты проводили на персональном компьютере с использованием программы OriginPro 7.0.

3.          Результаты и обсуждения

Для исследований изменений взаимосвязи кальциевого метаболизма и сократительной активности ГМК под действием ТК (в концентрациях от 10-6 до 10-4 моль/л) одновременно измерялась сила сокращения и  [Са2+]i. Известно, что сокращение ГМ в физиологических условиях развивается под действием либо факторов физической природы (например, растяжение), либо вследствие связывания экзо - и эндогенных биологически активных веществ с  их специфичными рецепторами на плазматической мембране, активации соответствующих ионных каналов, что в результате приводят к увеличению [Са2+]i и инициации сокращения ГМ. Сила сокращения ГМ зависит также от базального состояния сосудов и способа предварительной  активации ГМК, т.е. гиперкалиевым деполяризующим раствором или посредством активации альфа-адренорецепторов.  [3, 8]. Поэтому, принципиальным было выяснить действие препарата на фоне активации  различных  путей освобождения активирующего Са2+, а также оценить влияние ТК на базальный уровень [Са2+]i  и тонус ГМК.

На рис. 1 приведена оригинальная запись влияния ТК на базальный уровень изометрического напряжения деэндотелизированных ГМ аорты крысы [Са2+]i под действием ТК (10-4 моль/л). Видно, что добавление ТК в буферный раствор концентрации 10-4 моль/л приводило к констрикции ГМ и лишь кратковременному транзиторному увеличению  [Са2+]і, т.е. имела место диссоциация между изометрическим напряжением, развиваемым ГМ и [Са2+]і. Следует отметить, что ТК в низких концентрациях (10-6 моль/л) не вызывает видимых изменений в уровне тонуса и [Са2+]і.

 

Рис. 1 Оригинальная запись влияния ТК в концентрации 10-4 моль/л на базальный уровень изометрического напряжения и  [Ca2+]i в деэндотелизованых ГМК грудного отдела аорты здоровой крысы

Традиционно считается, что сила сокращения ГМК должна коррелировать с величиной [Ca2+]i. Однако существует точка зрения [16, 5], что тонус сосудов, в особенности в условиях патологии, может регулироваться механизмами связанными не с [Ca2+]i, а со сдвигами Ca2+-чувствительности миофибрилл [17, 18]. Полученный данные свидетельствуют, что  ТК  вызывала констрикцию ГМ за счет прироста [Ca2+]i  только на первой фазе сокращения. После достижения максимального значения [Ca2+]i, величина последней уменьшалась до начального базального значения, в то время как изометрическое напряжение ГМ увеличивалась до установленного значения (2,7±0,8) мН, n=5. Это свидетельствует о развитии эффекта сенситизации миофиламента к ионам кальция или, иными словами, об увеличении чувствительности сократительного аппарата ГМК аорты крыс к ионам кальция на фоне действия ТК.

Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что ТК в дозе 10-4 моль/л вызывала констрикцию не активированных ГМК преимущественно за счет увеличения кальциевой чувствительности миофибрилл.

Далее, для изучения действия ТК на ГМК было задействовано два пути предварительного повышения  [Са2+]i в ГМК при которых реализуются различные источники активирующего кальция. Использовался раствор с высоким содержанием K+ 60 (ммоль/л) и раствор фенилэфрина (ФЕ) 10-6 моль/л.

Рис. 2 Оригинальные кривые, демонстрирующие влияние  ТК на сократительную активность и [Ca2+]i в деэндотелизованых ГМК грудного отдела аорты крысы, предварительно сокращенных деполяризирующим раствором К+.

На рис. 2 представлена оригинальная запись сократительной активности и [Ca2+]i в ГМК грудного отдела аорты крысы, предварительно сокращенных деполяризирующим раствором К+, в ответ на добавление в буферный раствор ТК.

В концентрации 10-6 моль/л ТК статистически достоверно не влияла на силу сокращения и [Ca2+]i, однако в концентрации 10-4 моль/л приводила к релаксации ГМ на (48,6%±8,0)% и (66,0±9,1)% в деэндотелизированных и интактных препаратах сосудов, соответственно. При этом наблюдалось уменьшение [Са2+]і практически до базального уровня (на 72±15,1)% (n=5).

Представленные данные позволяют предположить, что ТК в дозе 10-4  моль/л приводила к закрытию Са-каналов L-типа, что подтверждается  известными данными об изменениях внутриклеточной концентрации цАМФ в результате связывания ТК с рецептором TGR5 [6].

На рис. 3 представлена оригинальная запись влияния ТК на сократительную активность и [Ca2+]i в деэндотелизированных ГМК грудного отдела аорты крыс, предварительно сокращенных ФЕ (10-6моль/л).

                В концентрации 10-4 ТК приводила к релаксации ГМ на (54,5%±9,0)% и уменьшению [Са2+]і до базального  уровня (n=5). Полученные данные дают основание предположить, что ТК способна ингибировать не только потенциал-управляемые Са-каналы L-типа, но и рецептор-управляемые  Ca-каналы. В тоже время, ТК в концентрации 10-6 моль/л не влияла на силу сокращения и [Ca2+]i предварительно сокращенных ГМК.

Рис. 3. Оригинальная запись влияния ТК в концентрации 10-4 моль/л  на уровень изометрического напряжения и [Ca2+]i в ГМК деэндотелизованых колец  грудного отдела аорты крысы, предварительно сокращенных  фенилэфрином в концентрации 10-6 моль/л.

Согласно современным представлениям, одним из  основных патогенетических факторов сердечнососудистых заболеваний считается нарушение функции эндотелия [12, 23, 19, 21, 22]. Эндотелий играет ключевую роль в поддержании нормального тонуса сосудов, обеспечении локального гомеостаза и пролиферации сосудистой стенки. Нарушение баланса между вазодилататорами и вазоконстрикторами является ключевым при эндотелиальной дисфункции [15]. Известно, что связывание FXR с ТК приводит к активации промотора NO-синтазы и соответственного увеличения концентрации NO в клетках эндотелия сосуда [10]. Поэтому, проведение  сравнительных исследований влияния ТК на интактные и деэндотелизированные сосуды являлось особенно актуальным.

На рис. 4. Представлена оригинальная запись влияния ТК на сократительную активность ГМ и [Ca2+]i в эндотелиальных клетках ([Ca2+]ie) грудного отдела аорты крыс. ГМ были предварительно активированы ФЕ (10-6моль/л). В концентрации 10-4, ТК приводила к релаксации ГМ на (68,2%±7,2)% и увеличению [Са2+]і в эндотелиальных клетках на (15,0±6,6)% (n=5). Таким образом, ТК вызывала эндотелий-зависимое расслабление в интактных сосудах грудного отдела аорты крыс. Повышение уровня [Ca2+]ie, в эндотелии свидетельствует о том, что вазодилатация ГМ, обусловлена активацией NO-синтазы и высвобождением NO из эндотелиоцитов.

 

Рис. 4. Оригинальная запись эндотелий-зависимой реакции  интактных ГМ аорты крысы на ТК в концентрации  10-4 моль/л. Регистрировалось  изменение уровня изометрического напряжения сосудов и [Ca2+]i в эндотелии (фокусирование на эндотелии) грудного отдела аорты крысы, предсокращенной фенилэфрином.

4.          Выводы

1.      В концентрации 10-6 моль/л ТК (действующее начало препарата Орион) статистически достоверно не влияла на сократительную активность ГМ и [Ca2+]i. В концентрации 10-4моль/л ТК вызывала констрикцию неактивированых, и вазодилатацию предварительно сокращенных сосудов крыс.

2.      Степень вазодилатации для сосудов крыс предварительно активированных раствором с высоким содержанием К+ (60 ммоль/л) составляло (48,6%+-8)% и  (54,5%±9,0)%  для, соответственно, деэндотелизированных и интактных ГМ, активированных ФЕ (10-6 моль/л) (n=5). Расслабление ГМК сопровождалось уменьшением [Ca2+]i  в ГМК до базального уровня (n=5).

3.      Полученные данные позволяют сделать предположение, что расслабление ГМК, индуцированное ТА  в концентрации 10-4 моль/л, может быть связано с  блокированием потенциалзависимых Са-каналов L-типа и/или рецепторсвязанных Са-каналов.

4.      В концентрации 10-4 моль/л ТК повышала базальный уровень [Ca2+]i в эндотелиоцитах и способствовала развитию эндотелий-зависимого расслабления.

5.      Констрикция неактивированных ГМ под действием ТК развивалась на фоне повышения кальциевой чувствительность миофибрилл.

            

 

 

 

Список литературы

1.         Х.К. Мурадян, В.Н. Бондарь, В.В. Безруков, О.И. Жуковский, В.И. Поляков, Н.А. Утко Влияние препарата «ОРИОН» на выживаемость в стрессорных условиях и продолжительность жизни Drosophila melanogaster // «Журн. АМН Украины» — 2009. — 16. – C. 246-262

2.         Baylor S. M., Hollingworth S. Measurement and interpretation of cytoplasmic [Ca2+]i signals from calcium-indicator dyes // News Physiol. Sci. — 2000. — 15.  Р. 19-25.

3.     Berridge MJ. Smooth muscle cell calcium activation mechanisms // J. Physiol. — 2008. — 586.  P. 5047-5061.

4.         Blatter L. A., Wier W. G. Intracellular diffusion, binding and compartmentalization of the fluorescent calcium indicators indo-1 and fura-2 // Biophys J. — 1990. — 58. — Р. 1491-1499.

5.         IV Kizub, OO Pavlova, CD Johnson, AI Soloviev, and AV Zholos Rho kinase and protein kinase C involvement in vascular smooth muscle myofilament calcium sensitization in arteries from diabetic rats // Br. J. Pharmacol. — 2010. — 159.  P. 1724–1731

6.     Kawamata Y, Fujii R, Hosoya M, et al. A G protein-coupled receptor responsive to bile acids // J. Biol. Chem. — 2003. — 278. — P. 9435-9440.

7.         Li T, Holmstrom SR, Kir S, Umetani M, Schmidt DR, Kliewer SA, Mangelsdorf DJ. The G protein-coupled bile acid receptor, TGR5, stimulates gallbladder filling. // Mol. Endocrinol. — 2011. — 25. 1066-1071.

8.     Lehen'kyi VV, Zelensky SN, Stefanov AV, Soloviev AI. Effects of nitric oxide donors on vascular smooth muscles depend on a type of vascular smooth-muscle preactivation // Cardiovasc. Toxicol. — 2002. — 02 . — P. 151-160.

9.     Li, J., Wilson, A., Kuruba, R., Zhang, Q., Gao, X., He, F., Zhang, L.M., Pitt, B.R., Xie, W., and Li, S. FXR-mediated regulation of eNOS expression in vascular endothelial cells // Cardiovasc. Res. — 2008. —  77. — 169-177.

10. Li, J., Wilson, A., Kuruba, R., Zhang, Q., Gao, X., He, F., Zhang, L.M., Pitt, B.R., Xie, W., and Li, S. FXR-mediated regulation of enos expression in vascular endothelial cells // Cardiovasc. Res. — 2008. — 77. — P. 169-177.

11. Li YTY, Swales KE, Thomas GJ, Warner TD, Bishop-Bailey D. Farnesoid X receptor ligands inhibit vascular smooth muscle cell inflammation and migration // Arterioscler. Thromb. Vasc. Bio.. — 2007. —  27. — P. 2606-2611.

12. McDaniel N. L., Chen X. L., Singer H. A., Murphy R. A., Rembold C. M. Nitrovasodilators relax arterial smooth muscle by decreasing [Ca2+]i and uncoupling stress from myosin phosphorylation // Am. J. Physiol. — 1992. — 263. — Р. C461-C467.

13. Makishima M., Okamoto A.Y., Repa J.J. et al. Identification of a nuclear receptor for bile acids // Science. — 1999. — 284. — P. 1362-1365.

14. Maruyama T, Miyamoto Y, Nakamura T, et al Identification of membrane-type receptor for bile acids (M-BAR) // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2003. — 298. — 714–723.

15. Rask-Madsen C, King GL. Mechanisms of Disease: endothelial dysfunction in insulin resistance and diabetes // Nat. Clin. Pract. Endocrinol. Metab. — 2007. — 3. — P. 46-56.

16. Anatoly I. Soloviev, Olga V. Basilyuk Evidence for decrease in myofilament responsiveness to Ca2+ during hypoxia in spontaneously active vascular smooth muscle in rats // Exper. Physiol. — 1993. — 78. — P. 395-402.

17.  Soloviev AI, Bershtein SA The contractile apparatus in vascular smooth muscle cells of spontaneously hypertensive rats possess increased calcium sensitivity: the possible role of protein kinase // C. J. Hypertens. — 1992. — 10. — P. 131-138.

18. Anatoly I. Soloviev, Sergey M. Tishkin, Sergey N. Zelensky et al. Ionizing radiation alters myofilament calcium sensitivity in vascular smooth muscle: potential role of protein kinase C // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. — 2005. — 289. — P. 755-762.

19. Soloviev A., Tishkin, S., Parshikov A., Ivanova I., Goncharov E., Gurney A. Mechanisms of endothelial dysfunction after ionized radiation: selective impairment of the nitric oxide component of endothelium-dependent vasodilation // Br. J. Pharmacol. — 2003. — 138. — P. 837-844.

20. Grynkiewicz G., Poenie G. M., Tsien. R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties // J. Biol. Chem.–1985, №260.–Р.3440-3450

21. Soloviev A., Parshikov A., Stefanov A. et al. Evidence for the involvement of protein kinase C in depression of endothelium-dependent vascular responses in spontaneously hypertensive rats // J. Vasc. Res. — 1998. — 35. — 325-331.

22. Soloviev A., Tiskin S., Parshikov A. et al. Depression of endothelium-dependent relaxation despite normal release of nitric oxide in the aorta of spontaneously hypertensive rats: possible role of protein kinase C // Endothelium-Derived Hyperpolarizations / Ed. by P. Vanhoutte. — Harwood Academic Publishers, 1999. — P. 289-296.

23. Su X., Katoch S. S., Moreland R. S. Cyclic nucleotides relax contractions of a-toxin permeabilized arteries without a proportional change in myosin light chain phosphorylation // Biophys. J. — 1996. — 70. — P. 385-391.

 

Д.С. Зеленский                                                          _______________________________

В.М. Бондарь – руководитель фонда*                        _______________________________

О.И. Жуковский – президент фонда*                     _______________________________

В.И. Поляков – председатель наблюдательного совета фонда*  ___________________

Анатолий Иванович Соловьёв – проф., д.м.н.                           _____________________

03680, г. Киев, ул. Эжена Потье, 14,

тел.: +38 050 445 57 69,

ел. адреса tonysolpharm@gmail.com

*Международный благотворительный фонд «Киевская Русь», 01014 Киев